引言

比葉面積（SLA）是一個(gè)與葉結(jié)構(gòu)相關(guān)的參數(shù)，通過(guò)測(cè)量單位干質(zhì)量的投影葉面積進(jìn)行量化，并與基于質(zhì)量和面積的光合作用-氮關(guān)系的變化模式相 關(guān)[1]。SLA代表單位面積葉質(zhì)量（LMA）的倒數(shù)[2]， 且被認(rèn)為是與在受控或自然環(huán)境下生長(zhǎng)的一系列草本和木本物種的光合能力相關(guān)的重要生態(tài)指 標(biāo)[3-6]。SLA[7-8]通過(guò)影響光捕獲和CO2與RuBisCO 酶羧基化位點(diǎn)的結(jié)合進(jìn)而影響光合能力[9-11]。該參數(shù)的變化源自葉片密度和厚度的變化。此外，葉片厚度[12-13]和LMA[2]因環(huán)境（營(yíng)養(yǎng)、水分、光照狀況等）和植物功能群的不同而不同，盡管LMA也可能獨(dú)立于葉片厚度而發(fā)生變化[12]。有趣的是，LMA與柵欄和海綿狀薄壁組織的厚度、上表皮表面和單位面積體積正相關(guān)，這進(jìn)一步凸現(xiàn)了解剖結(jié)構(gòu)對(duì)于全面理解LMA的重要性。同樣，組織密度也會(huì)受到水分含量和細(xì)胞質(zhì)成分的影響[14-17]。

許多環(huán)境因素，如光強(qiáng)和光質(zhì)、UV-B光、CO2濃度、臭氧、土壤板結(jié)度、水分脅迫、溫度、鹽和養(yǎng)分有效性等，都會(huì)影響葉面積和葉質(zhì)量之間的比率，從而影響SLA[2,18]。大量研究表明不同物種在多種環(huán)境下的葉密度和厚度可分別解釋LMA差異的80%和20%[2]。在這種情況下，葉片特征的改變可歸因于自然選擇引起的種間差異，或環(huán)境條件下表型可塑性引起的種內(nèi)變異[19]。相應(yīng)的，那些能夠根據(jù)資源供應(yīng)而改變?nèi)~片形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)和生理代謝的物種具有生態(tài)優(yōu)勢(shì)[20]。因此，SLA被視為物種之間以及不同環(huán)境之間的可塑性參數(shù)[21]，從而SLA被廣泛用于解釋和理解不同物種生長(zhǎng)模式的生態(tài)差異[2-4, 17, 22-23]。

一般來(lái)說(shuō)，SLA與相對(duì)生長(zhǎng)率（RGR）呈正相關(guān)，弱光下更明顯。然而關(guān)于養(yǎng)分有效性對(duì)SLA的影響尚不清楚[3,21]。例如，干旱地區(qū)生長(zhǎng)速率最高的桉樹(shù)表現(xiàn)出較厚的葉組織，因?yàn)樵摰貐^(qū)沒(méi)有光限制，從而表現(xiàn)出葉片較密和較厚的物種具有較高的水分利用效率[24]。在另一項(xiàng)關(guān)于非木本植物的研究中，在最佳營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和受控環(huán)境條件下種植時(shí)，種間RGR變異很大程度上受到SLA的影響[3]。在同一項(xiàng)研究中，自然條件下物種RGR和可用性氮之間的相關(guān)性分析表明，營(yíng)養(yǎng)豐富環(huán)境中的自然選擇有利于SLA較高的物種，而營(yíng)養(yǎng)貧乏環(huán)境中的自然選擇則相反[3]。因此認(rèn)為，SLA與半干旱地區(qū)植物中的氮質(zhì)量呈正相關(guān)，但在干旱地區(qū)SLA和氮質(zhì)量無(wú)關(guān)，這表明SLA的科屬依賴性反應(yīng)可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)水平產(chǎn)生影響[23]。然而，這些在自然環(huán)境中進(jìn)行的研究可能忽略了一個(gè)事實(shí)，即富氮環(huán)境可能與較高的植被覆蓋率相關(guān)，從而降低了光的可用性，因此光是一個(gè)干擾因素。

養(yǎng)分中，土壤和葉片中的氮含量被認(rèn)為是調(diào)節(jié)葉片形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)的重要因素[18,23]。研究認(rèn)為，隨著葉片氮含量的增加，不同物種有較高的SLA（或較低的LMA）[2,12,25-30]。除氮素外，輻照度以及氮素和光照的復(fù)合因素也會(huì)影響SLA[31-33]。令人驚訝的是，氮供應(yīng)對(duì)果實(shí)類(lèi)植物，甚至是作物類(lèi)植物的SLA影響仍未知。很少有在種內(nèi)水平和作物品種之間探討SLA的研究[8,26,30]。在這方面，我們之前已經(jīng)證實(shí)：（1）施氮對(duì)C.chinense辣椒的生長(zhǎng)和產(chǎn)量有較大影響，（2）C.chinense辣椒商品種Biquinho和Habanero在坐果率和果實(shí)大小、源庫(kù)比和葉片形態(tài)方面存在顯著差異[34]。因此，基于氮供應(yīng)對(duì)C.chinense辣椒生長(zhǎng)和果實(shí)產(chǎn)量的影響以及種內(nèi)差異，研究分析了氮供應(yīng)對(duì)SLA和相關(guān)性狀的影響。本研究驗(yàn)證了在供氮和遮陰條件下兩種C.chinense辣椒通過(guò)不同的代謝和結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)SLA的假設(shè)。首先，將兩種基因型辣椒置于0～312.5 mg/dm3一系列氮素濃度下，研究了氮對(duì)SLA和初級(jí)代謝物的影響。其次，研究在解剖學(xué)水平上放大了氮效應(yīng)，并研究了氮與其他常見(jiàn)的對(duì)SLA、葉片厚度和密度有影響的因素的交互作用。

1 材料與方法

1.1 植株生長(zhǎng)條件

品種Biquinho和Habanero（TopSeed?, Agristar do Brasil Ltd.）均為Capsicum chinense辣椒，其種子在商品基質(zhì)中發(fā)芽（Tropstrato?HT）；45 d后，將幼苗移植到裝有5 dm3黃-紅土壤的花盆中，以確保試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)根系發(fā)育沒(méi)有限制。盆土經(jīng)過(guò)篩選、混勻，并用CaCO3和MgCO3（摩爾比3.5∶1）調(diào)節(jié)至中性。之后，除氮外，土壤條件參照Novais 等[35]進(jìn)行施肥，磷、鉀、硫、硼、銅、鐵、錳、鉬和鋅施肥總量分別為300、150、40、0.81、1.33、1.55、3.66、0.15和4.00 mg/dm3。由于土壤中的氮含量較低，NH4NO3以5 mg/dm3的濃度施入盆中，以確保移栽后植株的初始發(fā)育。為了避免土壤中的氮淋失，用塑料袋蓋住盆底。以NH4NO3為氮源的第一次施氮是在第一分枝出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行的，這與生殖分化相對(duì)應(yīng)。如前所述，該物候期是根據(jù)葉片和果實(shí)的生長(zhǎng)速率及其對(duì)氮的需求來(lái)選擇的[36-37]。試驗(yàn)過(guò)程中，每天供水，使土壤保持恒定的田間持水量。

為了評(píng)估氮?jiǎng)┝亢驼陉帉?duì)SLA的影響，連續(xù)兩年進(jìn)行獨(dú)立試驗(yàn)。第1個(gè)試驗(yàn)中，從第一分枝出現(xiàn) 開(kāi) 始，0、20、50、125和312.5 mg/dm3的 氮素，以溶液形式每20 d施于土壤中，總共5次等量補(bǔ)充[34]。第1個(gè)試驗(yàn)是在溫室中進(jìn)行的，室內(nèi)溫度為25℃ ± 5℃，平均輻照度為500 μmol/（m2·s）。植株花后（DAF）培養(yǎng)91 d。所有試驗(yàn)分析均在2016年7月—10月進(jìn)行，在此期間平均光周期為11.5 h/12.5 h（白晝/夜間）（來(lái)源：美國(guó)華盛頓特區(qū)美國(guó)海軍天文臺(tái)天文應(yīng)用部），平均輻照度為 1 300 kJ/m2（資料來(lái)源：巴西國(guó)家氣象研究所）。第2個(gè)試驗(yàn)是為了分析氮供應(yīng)和光照強(qiáng)度對(duì)SLA的影響。植株生長(zhǎng)于溫度為27℃ ± 5℃，平均輻照度為800 μmol/（m2·s）的溫室當(dāng)中。當(dāng)?shù)谝环种π纬蓵r(shí)，將一半的植株置于50%的遮陰下，而其他植株則保持在正常光強(qiáng)下。同時(shí)，每20 d施用20或125 mg/dm3的氮肥，以補(bǔ)充前述的4個(gè)等量[38]。試驗(yàn)分析均在2017年2月—4月進(jìn)行，期間平均光周期為12 h 11 min / 11 h 49 min（晝/夜）（來(lái)源：美國(guó)海軍天文臺(tái)天文應(yīng)用部），平均照度為1 390 kJ/m2（資料來(lái)源：巴西國(guó)家氣象研究所）。植株花后培養(yǎng)74 d。

1.2 代謝物分析和氮含量測(cè)定

兩個(gè)試驗(yàn)均在花后59 d 和30 d分別采集完全展開(kāi)的第三片葉（從頂點(diǎn)往下數(shù)），采集葉片在液氮中快速冷凍，并儲(chǔ)存在 - 80℃冰箱中等待后續(xù)研究分析。代謝物提取是先在液氮中研磨，然后稱量質(zhì)量，并用乙醇提取[39]。在乙醇提取物中，筆者測(cè)定了蔗糖、果糖、葡萄糖[40]、蘋(píng)果酸[41]、總氨基酸[39]、 NH4

+[42]、NO3-[43]和葉綠素a、b的含量[44]。淀粉和蛋白含量按Bradford[45]和Fernie等[40]所述，用乙醇不溶性部分測(cè)定?？偟縿t參考Kalra （1998）[46]的方法于每次試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集葉片進(jìn)行測(cè)定。

1.3 比葉面積、解剖特征和葉密度的測(cè)定

參考Cavate等[47]的方法，兩個(gè)試驗(yàn)的SLA均使用葉盤(pán)測(cè)定。第1個(gè)試驗(yàn)中，從花后88 d植株的成熟葉片上采集9個(gè)1.03 cm2的圓盤(pán)狀葉片。第2個(gè)試驗(yàn)中，在花后10、30、50和70 d時(shí)采樣，每個(gè)處理分別采集6個(gè)圓盤(pán)狀葉片。研究所用結(jié)果為平均值，因?yàn)樵囼?yàn)發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移處理間沒(méi)有差異。此外，研究采用了第2種方法（Poorter和Remkes等[3]提出）測(cè)定SLA，即葉面積與其干質(zhì)量之比（m2/kg）。在該方法中，在花后72 d使用葉面積儀（Li 3100C Li Cor，Inc.，Lincoln，NE，USA）測(cè)量每處理植株的總?cè)~面積。之后，在80℃下對(duì)葉片進(jìn)行烘干稱量質(zhì)量，然后計(jì)算SLA。值得注意的是，這兩種方法的結(jié)果相似（附表S1）。

花后70 d（第2個(gè)試驗(yàn)）進(jìn)行葉片解剖結(jié)構(gòu)分析。為此，采集第三分枝上處于中等光照強(qiáng)度的完全展開(kāi)的健康葉片，在FAA50[48]中真空固定48 h，保存在70%乙醇中。根據(jù)使用說(shuō)明，每處理隨機(jī)選擇3個(gè)樣品，使用乙醇進(jìn)行梯度脫水，并用甲基丙烯酸乙二醇酯（徠卡?包埋試劑盒）包埋處理。在旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（型號(hào)RM2155，美國(guó)伊利諾伊州迪爾菲爾德萊卡微系統(tǒng)公司）中制作8 μm厚的橫截面，用甲苯胺藍(lán)[49]染色10 min后，用水沖洗并在室溫下干燥。載玻片用合成樹(shù)脂固定（Permount，F(xiàn)isher），以 便 在 光 學(xué) 顯 微 鏡（AX70-Olympus）中進(jìn)行觀察和記錄。利用Image Pro Plus軟件（MediaCybernetics）對(duì)顯微照片的葉片進(jìn)行化學(xué)計(jì)量分析。因此，試驗(yàn)對(duì)每處理的3株9個(gè)區(qū)域進(jìn)行了全葉厚度、柵欄薄壁組織厚度、海綿薄壁組織厚度和細(xì)胞間隙百分比的測(cè)定。根據(jù)第2個(gè)試驗(yàn)，根據(jù)以下方程式計(jì)算葉片密度：

葉片密度=圓盤(pán)狀葉干質(zhì)量/（圓盤(pán)狀葉面積×葉橫截面直徑）

根據(jù)第2個(gè)試驗(yàn)的描述進(jìn)行葉盤(pán)取樣，測(cè)定葉盤(pán)在已知面積內(nèi)的干質(zhì)量（打孔器面積為1.03 cm2）。上述圓盤(pán)葉來(lái)自于處于同一個(gè)體發(fā)育時(shí)期和生理階段的葉片，這些葉片均為完全展開(kāi)、成熟、健康和活躍的葉片。根據(jù)葉片橫截面測(cè)量葉片寬度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

第1個(gè)試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，變量為基因型和供氮量，共有5個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)的正態(tài)性通過(guò)夏皮洛-威爾克法檢驗(yàn)矯正，然后對(duì)所有變量進(jìn)行雙因素方差分析。使用多重比較法進(jìn)行基因型差異顯著性分析（P≤ 0.05），根據(jù)供氮量進(jìn)行回歸模型參數(shù)調(diào)整。第2個(gè)試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)[50]，3個(gè)變量：遮陰（光照和遮陰）為主處理，氮供應(yīng)（20或125 mg/dm3）為副處理，兩個(gè)基因型（Biquinho和Habanero）為子處理。每處理有6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。通過(guò)夏皮洛-威爾克法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，然后進(jìn)行三因素方差分析。采用F檢驗(yàn)和多重比較法檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)各因素差異顯著性的分析（P≤ 0.05）。對(duì)于特定葉面積，第1個(gè)試驗(yàn)中每處理5株重復(fù)，第2個(gè)試驗(yàn)每處理6株重復(fù)。葉片解剖和計(jì)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每株有3個(gè)組織學(xué)重復(fù)，因此每處理有9個(gè)切片。使用SigmaPlot v.11.0（美國(guó)加利福尼亞州圣何塞市Systat軟件公司）和R語(yǔ)言[51]（R核心團(tuán)隊(duì)2019）軟件繪制圖表，并進(jìn)行均值比較、回歸分析和皮爾遜相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 氮素供應(yīng)對(duì)SLA的影響

為了明確供氮量對(duì)辣椒（C.chinense）SLA的影響，本研究在5個(gè)氮?jiǎng)┝肯拢N植了在坐果率、果實(shí)大小、庫(kù)源比和葉片形態(tài)方面存在差異的兩個(gè)商品種（Biquinho和Habanero）[34]。每個(gè)品種以供氮量為變量調(diào)整回歸模型從而闡明SLA的變化（圖1a）。由圖1可知，不同處理下，兩品種的SLA均隨氮供應(yīng)的增加而下降。在20 mg/dm3和50 mg/dm3的氮素處理下，品種Biquinho的SLA高于品種Habanero（圖1a）。

在第2個(gè)試驗(yàn)中，結(jié)合兩個(gè)輻照度水平（800和400 μmol/（m2·s），研究?jī)煞N基因型的辣椒在中度缺氮和充足氮（20和125 mg/dm3）條件下SLA的變化。由表1可知，光照、供氮和基因型對(duì)辣椒SLA有顯著的三重交互作用（P= 0.041）。因此，可以根據(jù)基因型，確定光照或氮供應(yīng)水平之間是否存在差異（圖1b）。兩種基因型葉片的SLA在遮陰條件下都有所增加，但只有Biquinho的SLA在供氮量變化時(shí)表現(xiàn)出顯著差異（圖1b）。值得注意的是，盡管第1次500 μmol/（m2·s）和第2次800 μmol/（m2·s）試驗(yàn)的溫室輻照度不同，兩個(gè)品種在不同供氮量下的SLA表現(xiàn)出相似的變化（圖1）。

圖1 a．5個(gè)氮水平和500 μmol/（m2·s）處理下，花后88 d兩個(gè)辣椒品種的SLA； b.光照水平800和400 μmol/（m2·s）、氮供應(yīng)（20和125 mg/dm3）和基因型（Biquinho和Habanero）對(duì)SLA的三重影響

研究每株植物的總?cè)~面積除以單株葉片的總干質(zhì)量以便進(jìn)一步明確SLA的變化。正如預(yù)期的那樣，該分析證實(shí)了遮陰可提高兩種辣椒的SLA。在光照和遮陰條件下，SLA的值由19.36 ± 0.75 m2/kg 變?yōu)?7.49 ± 0.88 m2/kg（表1和附表S2）。此外，由表1可知針對(duì)SLA，氮供應(yīng)和基因型存在互作（表1）。結(jié)果表明，在20 mg/dm3氮條件下，品種Biquinho葉片表現(xiàn)出較高的SLA，而Habanero的SLA未觀察到氮效應(yīng)（圖2a）。

2.2 供氮對(duì)不同基因型葉片和薄壁組織厚度影響的差異

接下來(lái)，研究決定評(píng)估氮供應(yīng)和輻照度水平對(duì)SLA相關(guān)參數(shù)的影響。遮陰對(duì)相關(guān)解剖性狀的影響是獨(dú)立于供氮或基因型之外的，而供氮效應(yīng)與基因型有關(guān)（表1）。Habanero的植株在20 mg/dm3的氮處理下表現(xiàn)出較厚的葉子，而B(niǎo)iquinho的葉片厚度沒(méi)有影響（圖2b）。但在125 mg/dm3的氮處理下，Biquinho表現(xiàn)出較厚的柵欄組織，而對(duì)Habanero的柵欄薄壁組織厚度沒(méi)有受到氮供應(yīng)的影響（圖2c，3）。相比之下，在20 mg/dm3的氮處理下，Habanero表現(xiàn)出更厚的海綿狀薄壁組織，而B(niǎo)iquinho的該組織厚度與氮供應(yīng)無(wú)關(guān)（圖2 d，3）。此外，在20 mg/dm3的氮處理下，Habanero比Biquinho的海綿狀薄壁組織更厚，而在125 mg/dm3的氮處理下兩個(gè)材料無(wú)明顯差別?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明Biquinho主要表現(xiàn)為柵欄薄壁組織的改變，而Habanero顯示了海綿狀薄壁組織的變化，以響應(yīng)不同的氮供應(yīng)（圖3）。

圖2 對(duì)氮供應(yīng)（20或125 mg/dm3）和C.chinense（Biquinho或Habanero）基因型交互作用下的（a）比葉面積（SLA）（花后74 d的總?cè)~面積與葉干質(zhì)量比）、（b）葉厚度、（C）柵欄和（D）海綿狀薄壁組織（平均值± SE）進(jìn)行方差分析（表1）

圖3 花后70 d，遮陰和光照下，中度缺氮（20 mg/dm3）和氮充足（125 mg/dm3）時(shí)Biquinho和 Habanero兩個(gè)品種成熟葉片的橫截面

表1 利用三因素方差分析法以表明光照（光照和遮陰）、供氮（20或125 mg/dm3）、C.chinense基因型（Biquinho或Habanero）及其互作對(duì)成熟葉片的比葉面積、葉面厚度、柵欄和海綿狀薄壁組織的影響（第2個(gè)試驗(yàn)）

在第2個(gè)試驗(yàn)中，SLA分析是指開(kāi)花后10 d、30 d、50 d、70 d（它們之間沒(méi)有差異）[47]和74 d[3]收獲的葉盤(pán)平均數(shù)表示，同時(shí)選用開(kāi)花70 d的材料進(jìn)行解剖特征和葉密度的測(cè)定。數(shù)據(jù)用F值表示，且通過(guò)P值進(jìn)行顯著性分析。粗體數(shù)值表示數(shù)據(jù)通過(guò)F測(cè)驗(yàn)在P≤ 0.05下的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

aSLA的測(cè)定參照Cavate等[47]的方法。

bSLA的測(cè)定通過(guò)總?cè)~面積除以葉片的總干 質(zhì)量[3]。

此外，我們觀察到，遮陰對(duì)解剖特征的影響與氮供應(yīng)或基因型無(wú)關(guān)（附表S2）。與光下葉片厚度（217.7 ± 8.5 μm）相比，遮陰下兩個(gè)品種的葉片厚度較?。?91.6 ± 8.7 μm）（圖4a）。這與遮陰條件下較薄的柵欄和海綿狀薄壁組織的結(jié)論一致（圖4b，c）。遮陰和光照下柵欄薄壁組織的厚度分別為69.9 ± 2.6 μm和80.8 ± 4.8 μm（圖4b），海綿狀薄壁組織厚度分別為92.9 ± 6.4 μm和105.9 ±5.9 μm（圖4c）。

圖4 花后70 d，光照對(duì)兩種辣椒（Biquinho和Habanero）葉片的厚度（a）、柵欄組織厚度（b）和海綿組織厚度（c）的影響

與解剖特征相反，基因型對(duì)葉片密度沒(méi)有顯著影響（表1）。遮陰條件下Biquinho和Habanero的葉片密度較光照下的低（圖5）。隨著氮肥用量的增加，兩種辣椒均表現(xiàn)出較高的葉片密度（圖5）。

2.3 氮含量和氮代謝產(chǎn)物與SLA相關(guān)

為了確定氮供應(yīng)對(duì)碳氮相關(guān)的代謝物水平的影響，根據(jù)第1個(gè)試驗(yàn)的氮供應(yīng)分析了初級(jí)代謝物的變化（附圖S1）。接下來(lái)，對(duì)SLA值、氮含量和碳氮相關(guān)代謝物之間進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析（圖6）。皮爾遜相關(guān)分析是在兩個(gè)品種的代謝物、葉片性狀以及碳氮含量等與SLA正相關(guān)或負(fù)相關(guān)全部參數(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。氮含量與氮相關(guān)代謝物如氨基酸、蛋白質(zhì)、NH4t">+和NO3-之間呈正相關(guān)。另一方面，氮含量及氮相關(guān)代謝物含量都與SLA呈負(fù)相關(guān)（圖6）。相反，碳相關(guān)代謝物如淀粉、葡萄糖和蘋(píng)果酸的含量與SLA呈正相關(guān) （圖6）。

為了在第2個(gè)試驗(yàn)中驗(yàn)證初級(jí)代謝物對(duì)SLA的影響，利用之前對(duì)C.chinense[34]的研究獲得的數(shù)據(jù)，對(duì)不同光照及氮水平下對(duì)SLA和氮含量、氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉含量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析。在20～125 mg/dm3氮范圍內(nèi)，品種Biquinho的SLA隨著施氮量的增加（以及氮代謝產(chǎn)物）和柵欄薄壁組織厚度的增加而降低（圖2，7）。另一方面，在品種Habanero中觀察到的SLA微小變化，可能是為了響應(yīng)氮供應(yīng)增加，氮相關(guān)代謝物含量的輕微增加和葉片厚度（海綿狀薄壁組織）降低相互抵消后的結(jié)果。

3 討論

本次研究比較了在坐果率、果實(shí)大小和葉片形態(tài)上具有差異的兩個(gè)C.chinense種辣椒（Biquinho和Habanero），以便進(jìn)一步了解氮、光強(qiáng)及其互作對(duì)果實(shí)類(lèi)植物SLA的影響。我們之前的研究表明，辣椒植株葉片中的氮含量與施氮量成比例增加[34]。本研究表明，SLA與品種無(wú)關(guān)，各品種SLA均隨N劑量的增加而降低（圖1a）。為了更好地理解這一效應(yīng)，研究分析了不同光照水平以及在氮缺乏和充足情況下影響葉片密度、厚度及調(diào)節(jié)SLA因子[52]的性狀。遮陰條件下兩個(gè)品種的SLA均有所增加，且基因型和N劑量之間存在交互作用（圖1）。葉片密度隨著較高的細(xì)胞含量（如細(xì)胞內(nèi)含物、淀粉粒和晶體）和較高的細(xì)胞壁沉積[13,52]或更小的空氣空間體積而增加[2]。現(xiàn)有的研究中，在葉片橫截面上，柵欄薄壁組織比海綿薄壁組織顯示出更少的細(xì)胞間隙（圖3）。這兩個(gè)品種在葉片結(jié)構(gòu)參數(shù)（如柵欄和海綿狀薄壁組織）方面對(duì)氮肥的反應(yīng)不同（圖2）。Biquinho的柵欄薄壁組織厚度增加（圖2c），而Habanero的海綿薄壁組織減少（圖2d）。有趣的是，Habanero的葉片厚度減小，而B(niǎo)iquinho在較高氮?jiǎng)┝肯聟s保持穩(wěn)定（圖2b）。上述結(jié)果表明，這兩個(gè)品種具有明顯的葉肉細(xì)胞擴(kuò)張，這可能會(huì)調(diào)節(jié)其SLA和葉片厚度，但保持穩(wěn)定的葉片密度（圖5）。

圖5 花后70 d，不同光照水平800和400 μmol/（m2·s）與N供應(yīng)（20和125 mg/dm3）水平下Biquinho和Habanero辣椒的葉片密度

考慮到葉密度與代謝產(chǎn)物的關(guān)系，所有非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（可溶性糖和淀粉）與蛋白質(zhì)的總和可能對(duì)葉生物量有相當(dāng)大的影響[2,53-55]。本研究中，所有初級(jí)代謝產(chǎn)物貢獻(xiàn)了葉片干質(zhì)量的9.5%～28.1%（附圖S1），以響應(yīng)氮供應(yīng)量的增加。與其他代謝物相比，氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉含量的變化幅度更大。氨基酸在干葉中的質(zhì)量為0.7%～17%，蛋白質(zhì)占干葉質(zhì)量的0.6%～3.8%，兩者均與氮含量正相關(guān)，與SLA負(fù)相關(guān)（圖6）。另一方面，淀粉（占干葉質(zhì)量的2.1%～10.3%）與氮含量負(fù)相關(guān)，與SLA正相關(guān)（圖6）。與之一致的是，前人的研究表明，缺氮會(huì)導(dǎo)致碳代謝改變，例如蘋(píng)果酸和其他有機(jī)酸水平降低，淀粉水平增加[56-57]。 總之，當(dāng)?shù)?yīng)增加時(shí)與氮代謝相關(guān)的代謝物的合成是一個(gè)重要特征，此特征也與葉片密度增加有關(guān)（圖5）。

圖6 5個(gè)氮水平下，Biquinho和Habanero兩個(gè)辣椒品種的SLA、葉特性、碳含量、氮含量及碳氮相關(guān)代謝物間的皮爾遜相關(guān)分析

Poorter等[2]認(rèn)為在與氮代謝相關(guān)的細(xì)胞成分中，蛋白質(zhì)水平可能對(duì)SLA產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)含量的數(shù)量變化可能超過(guò)葉子中非結(jié)構(gòu)碳水化合物的變化[58]。本研究的結(jié)果表明氨基酸水平的變化也是決定SLA響應(yīng)氮供應(yīng)變化的重要因素（圖7和附圖S1）。某些氨基酸水平有利于調(diào)節(jié)硝酸鹽的吸收和氮同化[59-60]，同時(shí)也有助于滲透調(diào)節(jié)[61]，而滲透調(diào)節(jié)反過(guò)來(lái)又在細(xì)胞伸展中發(fā)揮有效作用[62]。因此，除了代謝作用外，氨基酸可能還具有結(jié)構(gòu)功能，不僅通過(guò)參與增加葉片密度直接影響SLA，而且可通過(guò)調(diào)控葉片解剖結(jié)構(gòu)來(lái)影響SLA?？偟膩?lái)說(shuō)，由養(yǎng)分供應(yīng)驅(qū)動(dòng)的葉面積和葉質(zhì)量之間關(guān)系的變化與葉密度的變化比與單位面積葉體積的變化關(guān)系更密切[2,8]。因此，我們推測(cè)兩種基因型（圖1a）的SLA反應(yīng)，至少部分的可以用氮和碳代謝相關(guān)初級(jí)代謝物（附圖S1）來(lái)解釋?zhuān)▓D5）。然而，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)充分闡明這些代謝物在控制辣椒葉片密度方面的具體功能。

由于兩種基因型在氮和碳相關(guān)代謝物對(duì)葉片密度等性狀影響上表現(xiàn)出相似的行為（附圖S1），因此研究認(rèn)為氮由中度缺乏到充足供應(yīng)（圖1b、2a）時(shí)，基因型之間的SLA不同源于葉片解剖結(jié)構(gòu)的可塑性不同（圖2b-d）。氮充足時(shí)，由于葉片密度的增加和柵欄薄壁組織的增厚，品種Biquinho的SLA降低（圖2c、3、5）。相反，隨著氮供應(yīng)的增加，品種Habanero由于海綿薄壁組織的變化導(dǎo)致葉片厚度的下降[30]，厚度變薄補(bǔ)償了葉片密度的變化，從而使SLA沒(méi)有變化（圖2b、d、3、5）。此外，由于柵欄薄壁組織比海綿薄壁組織密度更大[63]，在中度缺氮至充足氮范圍內(nèi)，品種Biquinho的SLA敏感性更高。Xiong等[8]研究不同品種水稻葉面積/葉質(zhì)量比對(duì)施氮變化的響應(yīng)差異時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象。

本研究明確了Biquinho和Habanero兩種基因型辣椒SLA變化的不同原因。研究結(jié)果表明，兩種基因型辣椒在氮供應(yīng)量增加時(shí)SLA均有所降低，這是因?yàn)榈吞枷嚓P(guān)代謝物（主要是氨基酸、蛋白質(zhì)和淀粉）的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致葉片密度增加（圖7和附圖S1）。然而，在中度缺氮到氮充足范圍內(nèi)，辣椒的SLA也受到材料表型可塑性的影響。隨著供氮量的增加，SLA在兩個(gè)基因型中表現(xiàn)出不同的變化，品種Biquinho具有更高的葉密度和更厚的柵欄薄壁組織，而Habanero辣椒則觀察到更高的葉密度和更薄的葉片厚度（與更薄的海綿薄壁組織 有關(guān)）。

雖然本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙比例的改變，但研究氮供應(yīng)對(duì)葉細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞壁厚度、細(xì)胞擴(kuò)張將有助于在分子水平上更好地理解氮對(duì)SLA及器官發(fā)生的影響[64]。了解環(huán)境條件如何影響葉片形態(tài)對(duì)于固定棲息地中的物種生存非常重要[31]。與其他物種類(lèi)似[3,31-33]，Biquinho和Habanero采用了類(lèi)似的策略來(lái)降低SLA以保證在弱光環(huán)境下存活。雖然兩個(gè)品種在極低和極高氮?jiǎng)┝肯卤憩F(xiàn)出相同的行為，但在中等氮?jiǎng)┝肯略耘鄷r(shí)表現(xiàn)不同。由此，在極端氮水平下Biquinho和Habanero辣椒在代謝方面表現(xiàn)出和其他研究一樣的響應(yīng)行為。然而，在中度缺氮或氮充足的條件下，兩種辣椒采用不同策略與結(jié)構(gòu)特征去調(diào)節(jié)SLA。推測(cè)這些品種的自然（或繁殖）棲息地中的氮可用性可以顯著影響SLA行 為[3]。鑒于SLA是決定不同物種在其自身環(huán)境中適應(yīng)性的一個(gè)重要特征，因此有必要進(jìn)一步研究SLA對(duì)氮供應(yīng)的分子、結(jié)構(gòu)和生理調(diào)節(jié)響應(yīng)。

作者貢獻(xiàn)

LAS, JAC-A和AN-N設(shè)計(jì)試驗(yàn)。LAS和JAC- A執(zhí)行試驗(yàn)和采樣。LAS, JAC-A, PMAC, EATP和NMS進(jìn)行分析測(cè)試。LAS, RPO-G, EATP和AN-N撰寫(xiě)論文。FMD, RPO-G, PMAC, AZ, WLA, RS, EATP和AN-N審閱修訂論文。

Acknowledgements

由國(guó)家科學(xué)技術(shù)發(fā)展委員會(huì)資助（CNPq）（ANN 306818/2016-7號(hào)，LAS 501090/2015-0號(hào)，WLA 402511/2016-6號(hào)）。米納斯吉拉斯州研究擴(kuò)展基金會(huì)（FAPEMIG）[授權(quán)編號(hào)：CRARED-00053-16 ANN]。感謝CNPq向RPO-G（流程號(hào)152121/2019-6）、ANN、FMD和WLA授予的研究經(jīng)費(fèi)。RS得到了愛(ài)爾蘭農(nóng)業(yè)、食品和海洋部（DAFM）研究經(jīng)費(fèi)（VICCI編號(hào)：14/S/819）的支持。我們還感謝Franciele Santos Oliveira女士對(duì)樣品制備的支持。