章曉鷹 顧超 馬道亮 張玨 高月求 孫學華

對于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型與疾病轉(zhuǎn)歸預后的關聯(lián)，不同的研究結(jié)論存在著較大的分歧，有的研究認為病毒C基因型患者更容易轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不c肝癌，而有些研究則認為與基因型無關；報道提示B基因型對干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)的療效優(yōu)于C 基因型，且C基因型也更容易發(fā)生多重核苷類藥物的耐藥變異[1-6]。但也有報道持不同觀點，認為不同基因型的耐藥變異無明顯區(qū)別[7-8]。

目前基因型與病毒變異關聯(lián)研究多集中于HBV P區(qū)，少有研究報道不同病毒基因型的HBV S蛋白變異差異，然而HBsAg不僅僅有B細胞表位，還含有輔助T細胞(T-helper，Th)表位與細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)表位[9-10]，均在宿主相關的免疫功能刺激中發(fā)揮重要作用[11]。但鑒于HBeAg血清學轉(zhuǎn)換過程中所產(chǎn)生的免疫壓力是S蛋白變異的主要原因[12]，并且，S蛋白的變異與病程和年齡有關[13]。因此，本研究重點分析比較了HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者HBV基因型的S蛋白變異差異，探討病毒基因型對疾病臨床轉(zhuǎn)歸可能的影響。

資料與方法

一、一般資料

2019年1月至2019年10月上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院東院肝炎科門診或住院的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者 99例，其中B基因型50例，C基因型49例。納入標準參照2015版《慢性乙型肝炎防治指南》[14]，所有患者均HBV DNA測序成功。HBeAg陰性慢性乙肝定義為HBeAg陰性、抗-HBe陽性，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)持續(xù)或反復異常，HBV DNA>2E3 IU/mL[14]。以上患者均有抗病毒藥物治療史。所有患者排除合并其他病毒感染。

二、儀器、試劑、檢測方法

1.DNA提取試劑盒為QIAmp Blood Mini Kit(QIAGEN,德國)；DNA第一次純化試劑盒為QIAGEN MinElute Purification Kit(QIAGEN，德國)；DNA第二次純化試劑盒為BigDye Xterminator Purification Kit(Applied Biosystems，美國)。之江生物乙型肝炎分型試劑盒。

2.實驗儀器：DNA測序儀(ABI 3500 Dx Genetic Analyzer，美國，Applied Biosystems)；實時熒光定量PCR儀(美國，ABI7500)

3.HBV DNA提?。喝』颊哐獫{(EDTA抗凝管)200 μL用于核酸提取，按說明書進行操作。根據(jù)Genbank HBV DNA(HBV genotype B DNA,complete genome,LC036263;HBV genotype C DNA,complete genome,AB644286)的S基因序列，利用Primer Primer 5.0設計引物，引物序列見表1。二者均涵蓋整個S蛋白。

4.PCR與S蛋白變異檢測：HBV DNA提取后分別進行PCR第一輪擴增與純化，純化后的PCR產(chǎn)物進行PCR第二輪擴增與純化，加入10 μL去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)，短時振蕩溶解DNA，95℃變性5 min，迅速置于冰上或4℃冷卻4 min，ABI 3500 Dx基因分析儀上樣測序。

第一輪PCR反應條件：5×PCR buffer 10 μL(含Tris 鹽酸 buffer，dNTP、Mg+)、Taq酶3 μL、10 μmol/L的上游引物與下游引物各1 μL(終濃度為200 nmol/L),DNA模板10 μL，補充蒸餾水25 μL至總體積為50 μL。

第一輪擴增條件：50 ℃尿嘧啶糖苷酶反應防污染 2 min；經(jīng)95 ℃ 預變性15 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；最后，72 ℃終延伸 7 min。

表1 HBV NDA S區(qū)引物序列

第二輪PCR反應條件：BigDye 2 μL、BigDye Sequencing buffer 3 μL、F或R引物0.5 μL(終濃度為250 nmol/L)，純化的DNA模板1 μL，補充蒸餾水13.5 μL至總體積為20 μL。

第二輪擴增條件：96 ℃ 預變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，共25個循環(huán)。

5.數(shù)據(jù)分析：利用Primer Primer 5.0將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，BLAST分析軟件進行氨基酸序列比對。

6.HBV基因分型：采用上海之江生物乙型肝炎分型試劑盒，嚴格按操作說明書進行。

三、統(tǒng)計學方法

利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例數(shù)(百分數(shù))表示，組間比較采用χ2檢驗；非正態(tài)分布計量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型患者一般資料

HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型患者的年齡、性別、HBV DNA載量差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型患者一般資料比較

二、HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型HBV S蛋白及各區(qū)域變異比較

HBeAg陰性慢性乙型肝炎C基因型S蛋白總體變異率高于B基因型，無論MHR還是MHR外以及MHR的”a”決定簇與MHR外的CTL+Th免疫表位、非免疫表位，C基因型變異率均高于B基因型，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型HBV S蛋白及各區(qū)域變異比較[例(%)]

三、HBeAg陰性慢性乙型肝炎B、C基因型HBV S蛋白變異熱點及差異

HBeAg陰性慢性乙型肝炎組患者B、C基因型HBV S蛋白總變異點分別為56點、106點，平均每人變異1.12(56/50例)和2.16(106/49例)。

MHR與“a”決定簇熱點變異位點為T/I126/T/S/A，B基因型與C 基因型分別為3例和13例，兩基因型之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.699，P=0.006)。MHR外非免疫表位熱點變異位點為I68T/N，B基因型與C 基因型分別為3例和14例，兩基因型間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.865，P=0.003)。MHR外免疫表位熱點變異位點為L21S，B基因型與C 基因型分別為6例和3例，連續(xù)校準統(tǒng)計學顯示這兩基因型之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，MHR外非免疫表位的P203R/L位點，B基因型與C 基因型分別0例與6例，連續(xù)校準顯示兩基因型差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.544，P=0.033)。

討 論

S蛋白的aa100-169 為主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)，為B淋巴細胞表位，“a”決定簇(aa124-147)即位于此區(qū)域，而aa1-99與aa170-226被稱為MHR外，在MHR 外分別有CTL表位、Th表位與非免疫表位[10，15]。

先前研究提示，經(jīng)過HBeAg至抗-HBe血清學轉(zhuǎn)換，MHR外變異率明顯升高，并在HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者達到峰值，認為S蛋白變異尤其是MHR外變異不僅為免疫壓力所致的后果，可能也是乙型肝炎復發(fā)的原因[16]。從本次觀察數(shù)據(jù)來看，HBeAg陰性慢性乙型肝炎C基因型患者S蛋白總體變異率明顯高于B基因型，且無論是MHR還是MHR外，以及MHR外的免疫表位與非免疫表位，或MHR內(nèi)的“a”決定簇，B與C基因型之間的變異差異均有統(tǒng)計學意義，提示C基因型更容易產(chǎn)生S蛋白變異，增加的變異位點為隨機性分布，因此，兩基因型之間的變異差異在S蛋白的各個區(qū)域相當。

由于C基因型不僅僅在B淋巴細胞表位，在CTL+Th免疫表位還有非免疫表位均出現(xiàn)變異增加，從理論而言MHR變異直接影響HBsAg抗原性，導致與抗體結(jié)合能力下降，這與疫苗等免疫逃逸有關，并可使體液免疫功能下降[9]；同樣MHR外區(qū)域由于含有CTL表位與Th表位，其變異也可影響患者的細胞免疫功能[10]。有研究提示S蛋白變異可通過誘導表面抗原合成的不平衡并使其在胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中停留，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急反應，這可能與肝臟疾病的嚴重性有關[17,18]。因此推測細胞免疫與體液免疫功能的影響或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急的產(chǎn)生等可能是不同基因型與疾病進展預后關聯(lián)的原因。

MHR 熱點變異位點為I/T126T/S/，此位點被稱之為“免疫逃逸”位點[9]，通常B基因型為蘇氨酸，C基因型為異亮氨酸。有研究稱，大部分C基因型患者為異亮氨酸，約有10%為蘇氨酸，但從異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸時伴隨著胸腺嘧啶(ATT)轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏?ACT)，這可以導致HBsAg 抗原性改變[12]。本研究結(jié)果顯示，該位點C基因型變異均高于B基因型，但此變異究竟是不是屬于亞型變異，以及此位點變異是否影響了HBsAg 抗原性，可能還要進一步觀察。除此之外，MHR外非免疫表位與免疫表位熱點變異位點分別為I68T/N與L21S，I68T/N在B、C基因型之間差異均有統(tǒng)計學意義，C基因型高于B基因型，而L21S則兩基因型之間無任何差異。但是，I68T/N變異及其變異的臨床意義尚未見報道，因此，本觀察僅能提示C基因型更容易出現(xiàn)I68T/N位點變異。有研究報道，有兩個C端區(qū)位點P203Q與S210R與肝癌顯著相關[18]，但此次觀察中，HBeAg陰性慢性乙型肝炎基因型之間P203R/L變異差異有統(tǒng)計學意義，C基因型高于B基因型，而S210R/I則未顯示該位點變異與基因型有關。

另外，由于S蛋白與P區(qū)的反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT區(qū))重疊，兩者之間變異可互為影響，但是，可產(chǎn)生核苷類藥物耐藥的變異位點多見于rtM204I/sW196*,rtA181T/sW172* 與rtV191I/sW182*這3個P與S區(qū)相關聯(lián)位點[19]。本實驗僅在HBeAg陰性慢性乙型肝炎C基因型患者中檢測出3例rtM204I/sW196*變異位點，患者均有拉米夫啶治療史，但無法確定S區(qū)與P區(qū)誰先變異。

總之，HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者C基因型較B 基因型更容易產(chǎn)生S 蛋白變異，并可能由此通過HBsAg免疫原性改變、或通過影響細胞免疫與體液免疫功能的或通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急等機制左右疾病的預后轉(zhuǎn)歸。