谷媛，項榮武，翟玉萱，魏峰，楊雪瑩，關(guān)婷婷，李曉慧，韓濤

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 醫(yī)療保障中心醫(yī)學(xué)信息數(shù)據(jù)室，遼寧 沈陽110003；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤二科，遼寧 沈陽110000）

結(jié)直腸癌又稱大腸癌，是最常見惡性腫瘤之一，在消化道腫瘤中，其發(fā)病率僅次于胃癌，并呈逐年上升的趨勢。發(fā)生結(jié)直腸癌的危險因素包括飲食、肥胖、抽煙、運動量不足等，患有炎癥性腸?。冃越Y(jié)腸炎或克羅恩病）者患結(jié)腸癌的風(fēng)險明顯增加[1-2]。結(jié)直腸癌治療方式包括手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療，然而其發(fā)病機制復(fù)雜，臨床對于其病因研究仍在不斷的探索中。由于結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，且缺乏早期診斷的生物標(biāo)志物，多數(shù)患者確診多為中晚期，5年生存率僅為15.8%～27.9%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[3]。而早期檢測為結(jié)直腸癌患者的存活率約為晚期癌癥的5 倍。因此，尋找新的、早期診斷的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物至關(guān)重要。有研究表明，多種mRNA 參與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程。本研究基于美國癌癥腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫對結(jié)腸癌組織及正常組織中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，并探討其相關(guān)分子機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov）下載所有結(jié)直腸癌mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均為原始Count數(shù)據(jù)。將下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至同一目錄，然后將數(shù)據(jù)整合處理成包含樣本ID、樣本名、患者一般資料、生存資料等數(shù)據(jù)的矩陣，共包含樣本740 例，其中，結(jié)直腸癌組織有571 例，正常組織有169 例。

1.2 差異表達(dá)分析

對mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行正常組織與癌癥組織的差異表達(dá)分析。將整理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 語言，利用edge R 工具包讀取文件，校正因子、估算變異系數(shù)、計算出所有數(shù)據(jù)的倍數(shù)變化（fold change, FC）值以及偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR）。然后，篩選出FC 值＜1，且P＜0.05 的mRNA 作為正常組織與癌組織有表達(dá)差異的基因，輸出差異基因校正后表達(dá)值。FC 值＞0 的基因為上調(diào)基因；FC 值＜0 的基因為下調(diào)基因。最后，根據(jù)edge R 工具包篩選出的結(jié)果將所有的mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所對應(yīng)的FC 值以及P值取以10 為底數(shù)的對數(shù)后，以-log10（FDR）為橫軸，以log10（FC）為縱軸，對所有的mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行散點圖及熱圖繪制。本次計算的篩選條件：FC=1，P=0.05。

1.3 GO及KEGG信號通路分析

為探討篩選出的差異基因的具體作用及通路，將根據(jù)測序分析FC 值篩選出的差異基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），設(shè)定篩選條件。最后將具有統(tǒng)計學(xué)意義的GO 及KEGG 富集通路作為差異基因的富集通路。注意KEGG 富集通路的篩選條件為P＜0.05。

1.4 關(guān)鍵基因篩選

由于mRNA 直接調(diào)控特定蛋白的合成，所以基于這些mRNA 差異表達(dá)基因，研究其相對應(yīng)的蛋白的相互關(guān)系是必要的。通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）對FDR 值前200 個的mRNA 差異基因進(jìn)行分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape 3.4.0 軟件對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化并調(diào)整圖片格式。在R 語言環(huán)境下，將網(wǎng)絡(luò)節(jié)點從高到低排序，篩選出節(jié)點排在前7 位的mRNA 作為結(jié)直腸癌研究的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析。

1.5 基因表達(dá)水平及生存分析

比較關(guān)鍵基因在癌組織及正常組織中的表達(dá)水平。以關(guān)鍵基因的中位表達(dá)水平為界值，將關(guān)鍵基因分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，比較高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存情況：以PLKI 相對表達(dá)量中位值（7.02）為界，將樣本分為PLK1 高表達(dá)組（n=135）與PLK1 低表達(dá)組（n=134）；以SUV39H1 相對表達(dá)量中位值（7.28）為界，將樣本分為SUV39H1 高表達(dá)組（n=181）與SUV39H1 低表達(dá)組（n=181）；以HIST2H4B 相對表達(dá)量中位值（8.66）為界，將樣本分為HIST2H4B 高表達(dá)組（n=180）與HIST2H4B 低表達(dá)組（n=181）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件及R 語言軟件包處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制關(guān)鍵基因高表達(dá)與低表達(dá)的生存曲線，比較采用Log rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果

根據(jù)差異基因的篩選條件，共篩選出5 073 個差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)基因2 136 個，下調(diào)基因2 937 個。見圖1、2。

圖1 基因差異表達(dá)散點圖

2.2 GO及KEGG富集分析結(jié)果

GO 分析結(jié)果顯示，其生物過程主要在細(xì)胞增殖（GO：0008283）、轉(zhuǎn)運（GO：0006810）、rRNA 加工（GO：0006364）、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（GO：0006898）等功能富集（見圖3 和表1）。KEGG 富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因的信號通路主要有細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄失調(diào)、膽汁分泌、甲狀腺激素、血小板活化等信號通路（見表2 和圖4）。

表2 KEGG富集分析列表（前5）

圖4 差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析結(jié)果

表1 差異表達(dá)基因GO富集列表（前4）

圖3 差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

圖2 基因差異表達(dá)熱圖

STRING 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，共發(fā)現(xiàn)115 個節(jié)點蛋白和99 條相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中PLK1 蛋白在網(wǎng)絡(luò)圖中處于核心地位。將網(wǎng)絡(luò)節(jié)點從高到低排序，篩選出節(jié)點排在前7 位關(guān)鍵基因分別為PLK1、BRD4、EHMT2、HIST2H4B、PRPF19、SUV39H1、TRIM28。見圖5。

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 關(guān)鍵基因表達(dá)水平驗證

癌組織PLK1 相對表達(dá)量為（7.04±0.53），正常組織為（6.16±0.30），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.707，P=0.000），癌組織高于正常組織。癌組織PRPF19 相對表達(dá)量為（1 963.45±513.12），正常組織為（1 169.50±343.43），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.272，P=0.000），癌組織高于正常組織。癌組織SUV39H1 相對表達(dá)量為（7.22±0.38），正常組織為（6.69±0.15），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.144，P=0.000），癌組織高于正常組織。

2.5 關(guān)鍵基因生存分析

PLK1 高表達(dá)組與PLK1 低表達(dá)組5年生存率分別為70.37%（95/135）和60.45%（81/134），經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.972，P=0.087）。SUV39H1高表達(dá)組與SUV39H1 低表達(dá)組5年生存率分別為58.56%（106/181）和64.64%（117/181），經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.413，P=0.235）。HIST2H4B 高表達(dá)組與HIST2H4B 低表達(dá)組5年生存率分別為57.22%（103/180）和74.58%（135/181），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.113，P=0.001）。

PLK1 高表達(dá)組總生存時間為47.25 個月（95%CI：44.146，50.362），PLK1 低表達(dá)組總生存時間為42.71 個月（95% CI：39.987，45.434），經(jīng)Log rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.957，P=0.083）。SUV39H1 高表達(dá)組總生存時間為35.07 個月（95%CI：31.364，38.784），SUV39H1 低表達(dá)組總生存時間為33.50個月（95%CI：29.762，37.239），經(jīng)Log rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.134，P=0.820）。HIST2H4B高表達(dá)組總生存時間為34.32 個月（95% CI：32.841，47.265），HIST2H4B 低表達(dá)組總生存時間為41.58 個月（95% CI：38.541，51.517），經(jīng)Log rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.670，P=0.015），HIST2H4B 低表達(dá)組長于HIST2H4B高表達(dá)組。見圖6。

圖6 生存曲線圖

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生的危險因素多樣。目前通過早期篩查高危人群、改變不良的飲食生活習(xí)慣等方式預(yù)防直腸癌發(fā)病，且可通過靶向治療、化學(xué)治療、放射治療、外科手術(shù)、免疫治療等綜合方法對其進(jìn)行治療，但總體預(yù)后欠佳。因此，探索與結(jié)直腸癌發(fā)病機制、預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵分子標(biāo)志物對其早期診斷及治療十分重要。本研究采用生物信息學(xué)方法從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取571 個結(jié)直腸組織樣本，169 個正常組織樣本，經(jīng)過篩選得到5 037 個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因2 136 個，下調(diào)基因2 937 個，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果篩選出前7 位關(guān)鍵基因為PLK1、BRD4、EHMT2、HIST2H4B、PRPF19、SUV39H1、TRIM28。功能富集分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵基因主要涉及細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)運、rRNA 加工、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；信號通路分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因參與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄失調(diào)、膽汁分泌、甲狀腺激素、血小板活化等過程。進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)，HIST2H4B高表達(dá)組與HIST2H4B 低表達(dá)組總生存時間有差異。

PLK1 為保守的絲/蘇氨酸激酶家族成員，廣泛存在于真核細(xì)胞中，富集在細(xì)胞周期通路，參與細(xì)胞增殖、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M 轉(zhuǎn)換等生物過程，可直接磷酸化Cdc25 和Cyclin B1，在有絲分裂中起重要作用，其表達(dá)量與有絲分裂的活性呈正相關(guān)，可能通過P53 信號通路發(fā)揮作用[4]。多項研究表明，PLK1 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌等癌癥中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)[5-7]。本研究中，PLK1 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。HAN 等[8]研究表明，PLK1 在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)，且與Duke 分期、腫瘤大小、浸潤程度、淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，PLK1 水平在快速增殖的細(xì)胞中普遍升高，PLK1 缺失可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW1116 的遷移和侵襲能力，此外，對PLK1 進(jìn)行干擾可顯著抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲。

BRD4 是溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)家族成員，在炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)展、腫瘤惡性進(jìn)展等生物過程中發(fā)揮重要作用[9]。EHMT2 是組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，在膀胱癌、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)功能有關(guān)[10]，但其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)研究較少。SUV39H1 是一種專門負(fù)責(zé)組蛋白H3K9 三甲基化修飾的組蛋白甲基化酶，催化甲基從s-腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)移到組蛋白（特別是組蛋白H3 和H4）賴氨酸殘基上，在有絲分裂期定位于著絲粒，在有絲分裂進(jìn)行中起重要的調(diào)控作用，參與異染色質(zhì)的形成和基因沉默，且H3K9 的甲基化是一個非常保守的表觀修飾，是異染色質(zhì)形成和轉(zhuǎn)錄沉默的標(biāo)志。甲基化的失調(diào)在癌癥的發(fā)展過程中至關(guān)重要。有研究表明，在宮頸癌及卵巢癌組織中Suv39H1 蛋白均呈高表達(dá)[11]，且與原發(fā)性高草尿癥I 型和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等疾病進(jìn)展相關(guān)。另有研究表明，SUV39H1siRNA 能抑制急性髓系白血病細(xì)胞株KG-1 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，有望成為白血病治療的新靶點[12]。TRIM28 是包含多個結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白，屬于人類三聚體蛋白家族中的一員，以存在4 個保守結(jié)構(gòu)域即RING 指和B-box 1 型、2 型及亮氨酸卷曲螺旋結(jié)構(gòu)為主要特征。TRIM28 主要與含KRAB 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活或共抑制作用，并在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[13]。

綜上所述，基于TCGA 數(shù)據(jù)庫分析出PLK1 在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其參與細(xì)胞增殖、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M 轉(zhuǎn)換等生物過程，通過P53信號通路發(fā)揮作用，有望成為診斷結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物。