譚琳，謝瑜，楊堅，黃穎

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液科，云南 昆明650032）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenic purpura, ITP）病理機制為血小板計數(shù)（platelet count, PLT）下降，伴或不伴皮膚黏膜出血，其發(fā)病機制尚存在爭議，認(rèn)為免疫作用在其中起主導(dǎo)地位[1]。ITP 發(fā)生后，B 淋巴細胞功能亢進，產(chǎn)生針對血小板抗原的自身反應(yīng)性抗體，導(dǎo)致血小板的破壞增加和生成減少[2]。近年來有研究報道，ITP 發(fā)生、發(fā)展的分子機制可能與microRNA（miRNA）有關(guān)，認(rèn)為其可通過與靶基因的3′-非編碼區(qū)（UTR）結(jié)合而對靶基因的表達發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)多種蛋白的合成而參與多個細胞生物活動過程[3]。多種miRNA 表達與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，目前報道的有miR-142、 miR-143、 miR-181、 miR-30a-3p、 miR-223[4-7]。有報道顯示，在EB 病毒陽性皮肌炎患者中發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p 靶向調(diào)控ANXA1，從而促進外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）相關(guān)炎癥因子的表達及皮肌炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者PBMC 中miR-223 異常表達，介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究前期通過靶基因生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在ITP 患者PBMC 中存在異常表達的miR-30a、miR-181a，考慮其可能作為ITP 發(fā)病的靶基因，但目前國內(nèi)外尚無該類報道。因此本研究旨在明確miR-30a、miR-181a 在ITP 中的表達及其臨床意義，初步明確其是否可作為ITP 的潛在治療靶點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2020年12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的ITP 患者48 例作為ITP 組，另取同期本院40 例化療后骨髓抑制血小板減少患者作為對照組，體檢健康者45 例作為健康組。本研究獲得醫(yī)院倫理會批準(zhǔn)，所有患者家屬知情并簽署同意書。ITP 組男性23 例，女性25 例；中位年齡35 歲，平均（35.62±5.25）歲；PLT 0～55×109/L；平均血小板體積（mean platelet volume, MPV）3.5～7.9 fl，平均（5.62±1.33）fl；出血分級：0 級8 例，1 級10 例，2 級11 例，3 級13 例，4 級6 例。對照組男性19 例，女性21 例；中位年齡36 歲，平均（36.08±5.31）歲；PLT 70×109/L～120×109/L，平均（85.73±10.19）×109/L；MPV 5～10 fl，平 均（6.52±1.37）fl。健康組男性22 例，女性23 例；中位年齡37 歲，平均（36.15±5.37）歲；PLT 82×109/L～290×109/L，平均（178.96±22.33）×109/L；MPV 7～11 fl，平均（7.88±1.48）fl。3 組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①由?？漆t(yī)師根據(jù)診療共識確診為ITP[8]；②年齡≥18 歲；③肝腎功能正常，無其他自身免疫性疾?。虎芤缽男暂^好；⑤無溝通障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，能接受各項檢查；⑥無潰瘍病史或未長期使用免疫調(diào)節(jié)劑。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①胃腸手術(shù)史；②難治性或無法控制的高血壓、糖尿病等原發(fā)性疾病；③合并惡性腫瘤；④合并大出血或內(nèi)出血性疾??；⑤合并代謝性疾??；⑥各系統(tǒng)組織潰瘍。

1.3 方法

采集受試者空腹靜脈血檢測MPV 和PLT。采集受試者空腹靜脈血5 ml 置于枸櫞酸抗凝管中，采用密度梯度離心法分離PBMC，總RNA 提取試劑盒（北京厚生博泰科技有限公司）提取細胞總RNA，消除RNA 中基因組DNA 并除去DNase1 后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen 公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA 為模板參照引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）擴增。qRT-PCR 擴增體系：SYBR Green Mix 10 μl，正向引物0.5 μl（10 μmol/L），反向引物0.5 μl（10 μmol/L），cDNA 模板1 μl，ddH2O 8 μl。qRTPCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，56℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共計39 次循環(huán)。qRTPCR 引物序列見表1。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)（美國Alpha Inotech 公司）掃描分析，測定各擴增帶吸光度值，以目的基因與β-actin 吸光度比值計算miR-30a、miR-181a 相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Spearman 法；影響因素的分析用多因素一般Logistic 回歸模型，將獨立危險因素擬合多變量的臨床模型；繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者miR-30a、miR-181a 相對表達量及PLT、MPV比較

3 組患者miR-30a、miR-181a 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：ITP 組高于對照組和健康組（P＜0.05）。3 組患者PLT、MPV 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：ITP 組低于對照組和健康組（P＜0.05）。見表2。

表2 3組患者miR-30a、miR-181a相對表達量及PLT、MPV比較 （±s）

表2 3組患者miR-30a、miR-181a相對表達量及PLT、MPV比較 （±s）

組別ITP組對照組健康組F 值P 值n 48 40 45 miR-30a 3.05±0.86 1.78±0.52 1.28±0.34 100.030 0.000 miR-181a 16.25±3.05 9.85±2.26 7.66±2.01 148.060 0.000 PLT/（×109/L）6.22±1.05 85.73±10.19 178.96±22.33 1731.018 0.000 MPV/fl 5.62±1.33 6.52±1.37 7.88±1.48 30.780 0.000

2.2 miR-30a、miR-181a與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-30a與年齡和性別無關(guān)（P＞0.05），與PLT、MPV 呈負相關(guān)（P＜0.05），與出血分級呈正相關(guān)（P＜0.05）。miR-181a 與年齡和性別無關(guān)（P＞0.05），與PLT、MPV 呈負相關(guān)（P＜0.05），與出血分級呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-30a、miR-181a與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 發(fā)生ITP的多因素Logistic回歸分析

以是否發(fā)生ITP 為因變量（是=1，否=0），以年齡、性別、PLT、MPV、出血分級及miR-30a、miR-181a 相對表達量為自變量，進行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示：MPV [=0.685（95% CI：0.332，0.968）]、miR-30a [=1.876（95% CI：1.230，6.336）]和miR-181a [=2.665（95% CI：1.365，8.558）]是發(fā)生ITP 的影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 發(fā)生ITP的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

2.4 臨床模型建立與評估

選擇多因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)（MPV、miR-30a相對表達量、miR-181a相對表達量）及其回歸系數(shù)建立臨床模型的多元回歸方程：Logistic（P）=-4.115+1.305×MPV-1.258×miR-30a-1.664×miR-181a。在臨床模型中，MPV 6.2～11.0 fl定義為0，MPV ＜6.2 fl 定義為1；miR-30a 相對表達量＜2.85 定義為0，≥2.85 定義為1；miR-181a 相對表達量＜8.44 定義為0，≥8.44 定義為1。臨床模型診斷ITP 的標(biāo)準(zhǔn)誤為0.055，AUC 為0.889（95%CI：0.662，0.956），敏感性為75.25%（95% CI：1.123，2.084）、特異性為88.24%（95% CI：1.672，2.583）（見圖1）。選擇48 例ITP 組患者中的11 例，基于臨床模型下的散點圖經(jīng)過9 次迭代后達精度要求，利用制定好的臨床模型對所有樣本進行診斷測試；散點均圍繞參考線波動，未顯著偏離，診斷ITP的敏感性為90.00%（9/10），特異性為100.00%（1/1），總準(zhǔn)確率為90.91%（10/11）。

圖1 臨床模型診斷ITP的ROC曲線

2.5 臨床模型的臨床效能評估

極端情況下，預(yù)測未發(fā)生ITP 臨床凈獲益為0（紅色斜線），預(yù)測發(fā)生ITP 臨床凈獲益為0～3（藍色斜線）；正常情況下，DCA 決策曲線斜率高于2 條極端線。見圖2。

圖2 臨床模型預(yù)測ITP的DCA決策曲線

3 討論

近年來關(guān)于免疫功能、微炎癥狀態(tài)與ITP 密切相關(guān)的報道較多，已證實ITP 患者機體內(nèi)內(nèi)源性或外源性抗原可導(dǎo)致毛細血管及微靜動脈變態(tài)反應(yīng)而激發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性疾病中存在500 多個miRNA，而健康者與ITP患兒及不同出血分級、類型的ITP 患兒間存在60 多個miRNA 差異性表達，提示miRNA 可能參與ITP 的發(fā)生、發(fā)展[10]。本研究中ITP 組PMBC 中miR-30a、miR-181a 相對表達量顯著高于健康組，與吳曉芳等[11]報道m(xù)iR-30a 通過介導(dǎo)Th17 細胞分化影響ITP發(fā)病的研究結(jié)果一致。本研究中miRNA 差異與既往報道有所區(qū)別，與不同物種、樣本來源和疾病階段、病情等有關(guān)[12-13]。王毅力等[12]報道，ITP 患者PMBC 中可檢測到異常表達的miR-146a，其可鑒別診斷ITP 和急性髓系白血病。miRNA 由體內(nèi)大多數(shù)細胞產(chǎn)生后分泌到外泌體中，進入循環(huán)細胞后被其他細胞攝取，在血液和各細胞組織間轉(zhuǎn)運異常和/或機體表達抗炎miRNA 的能力受損時促進自身免疫性疾病的發(fā)病。有研究發(fā)現(xiàn)，MEK-ERK 通路激活后可誘導(dǎo)miR-30a、miR-181a 的表達，而其又可負向調(diào)節(jié)信號通路[14]。miR-30a 通過靶向位點結(jié)合SOCS3，影響Th17細胞分化，參與ITP發(fā)病[11]。

臨床骨髓巨噬細胞增生活躍時，外周MPV 增大，由于ITP 患者血小板破壞過多，骨髓巨核細胞代償性增生活躍，且血小板代謝旺盛，導(dǎo)致MPV迅速升高。有研究顯示，MPV 在PLT 明顯升高之前，已發(fā)生顯著變化，提示MPV 在判斷ITP 的發(fā)生、發(fā)展更敏感[15]。MPV 升高被認(rèn)為是ITP 發(fā)生的危險因素，血小板功能直接決定骨髓巨核細胞功能特點，骨髓代償功能異常可誘發(fā)ITP[16]。本研究中MPV 預(yù)測ITP 具有較高的準(zhǔn)確性，與既往報道結(jié)果基本一致[13]。既往研究認(rèn)為，miRNA 可調(diào)控血小板誘導(dǎo)的炎癥因子合成及PBMC 增殖；同時，miRNA 通過促進/抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性來影響T 細胞增殖，直接影響T 細胞活化誘導(dǎo)的細胞死亡過程[13]。本研究未分析相關(guān)炎癥因子，但通過檢測miR-30a、miR-181a 相對表達量發(fā)現(xiàn)，其在ITP 患者中變化較為敏感，與MPV、PLT 呈負相關(guān)，與出血分級呈正相關(guān)，提示其參與ITP 的發(fā)生機制。miR-30a 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫機制[17]，由相對表達量在一定程度反映了機體免疫功能，miR-30a 表達升高，提示機體免疫功能差，血小板代謝旺盛引起自身免疫性疾病。ITP 發(fā)生后，大量炎癥因子釋放，加劇了氧化應(yīng)激和免疫功能受損，導(dǎo)致受體相關(guān)激酶變化，引起miR-181a 改變，加劇血小板損傷。本研究結(jié)合多項臨床資料，進行單因素和多因素分析，建立的MPV、miR-30a、miR-181a 臨床模型區(qū)分度評估中，AUC 為0.889，提示準(zhǔn)確度高，略高于MAXIMILIAN 等[18]的報道結(jié)果，與選擇的預(yù)測因子不同有關(guān)。校準(zhǔn)度評估中，散點圖示散點均圍繞參考線波動，未顯著偏離參考線；說明該臨床模型具有較好的區(qū)分度和校準(zhǔn)度，對預(yù)測ITP 的發(fā)生概率具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性。DCA 決策曲線分析說明本預(yù)測模型具有較好的臨床應(yīng)用價值，使用該模型的患者能從中獲益。

綜上所述，miR-30a、miR-181a 與ITP 發(fā)生相關(guān)，通過miR-30a、miR-181a 建立個體化預(yù)測模型可準(zhǔn)確判斷ITP 的發(fā)生，且具有較高的臨床實用價值。