楊青青，陸強(qiáng)，劉佳

（蘇北人民醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 揚(yáng)州225001）

嬰幼兒階段是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的高峰期和敏感期，該階段神經(jīng)系統(tǒng)可塑性強(qiáng)，易受外界刺激[1]。有研究顯示，圍生期使用麻醉藥物可能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，損傷神經(jīng)元，進(jìn)而影響認(rèn)知功能[2]。依托咪酯是臨床圍生期患兒手術(shù)常用的全身麻醉藥[3]。有研究表明，依托咪酯可通過(guò)興奮γ-氨基丁酸受體，抑制神經(jīng)系統(tǒng)興奮，產(chǎn)生麻醉效果，但其對(duì)中樞神經(jīng)元的影響及對(duì)遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響尚存在爭(zhēng)議[4]。另有研究表明，中樞膽堿能系統(tǒng)，尤其是煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）功能與認(rèn)知功能關(guān)系密切[5]。本研究通過(guò)觀察新生大鼠依托咪酯暴露后的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能變化，并觀察nAChR 功能的變化，為臨床研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD 大鼠，48 只，7 d 齡，均為雄性，體質(zhì)量10～15 g，飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0044。

1.2 主要試劑與儀器

依托咪酯注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32022379，規(guī)格10 ml：20 mg，批號(hào)20191022），α7nAChR 激動(dòng)劑PNU-282987（北京百奧萊博科技有限公司，純度99.37%，規(guī)格10 mg，貨號(hào)M06398）。兔抗大鼠α7nAChR、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）單抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 單抗（北京博生福生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)IG101），α7nAChR 和AChE 引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。XR-XY1032 Y 型電迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），3-15 實(shí)驗(yàn)室通用型離心機(jī)（德國(guó)SIGMA 公司），MRX A2000 型酶標(biāo)儀（韓國(guó)K LAB OPTIZEN 公司），ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司），DYY-6D 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及干預(yù) 將48 只新生大鼠隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組、依托咪酯組、激動(dòng)劑組，每組16 只。根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算等效劑量[6]，對(duì)照組、依托咪酯組、激動(dòng)劑組分別單次腹腔注射生理鹽水10 ml/kg、依托咪酯5 mg/kg、依托咪酯5 mg/kg + α7nAChR 激動(dòng)劑PNU-282987 5 mg/kg。

1.3.2 認(rèn)知功能行為學(xué)測(cè)試 麻醉清醒后2 h，各組隨機(jī)取8 只大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，各組剩余8 只飼養(yǎng)至第4 周再進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。在安靜、環(huán)境溫度（24±2）℃條件下開展測(cè)試，所有測(cè)試由同一實(shí)驗(yàn)人員完成。①洞板實(shí)驗(yàn)：將新生大鼠放入洞板實(shí)驗(yàn)箱（21 cm×21 cm 平臺(tái)，平臺(tái)高出臺(tái)面15 cm，平臺(tái)均勻分布16 個(gè)洞）中央，統(tǒng)計(jì)3 min 內(nèi)探洞次數(shù)[7]。②Y 電迷宮實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入Y 電迷宮，自由活動(dòng)5 min 適應(yīng)環(huán)境，采用隨機(jī)不休息法，測(cè)試20 次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時(shí)間[8]。以受電擊后從起步區(qū)逃至安全區(qū)或通電10 s 內(nèi)直接跑至安全區(qū)為正確反應(yīng)次數(shù)；完成20 次測(cè)試時(shí)所需總反應(yīng)時(shí)間（通電至大鼠第一次逃至燈亮區(qū)的時(shí)間，包括正確反應(yīng)和錯(cuò)誤反應(yīng)所需時(shí)間）。

1.3.3 海馬組織α7nAChR、AChE mRNA 的檢測(cè) 取完成行為學(xué)測(cè)試的各組大鼠（麻醉清醒后2 h 和4 周各組8 只），用二氧化碳CO2窒息處死，斷頭取雙側(cè)海馬組織，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用Trizol 法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，獲得cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）反應(yīng)，按照試劑盒說(shuō)明書設(shè)定反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性25 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，共38 次循環(huán)，擴(kuò)增至熒光信號(hào)閾值所需循環(huán)次數(shù)，以肌動(dòng)蛋白（βactin）為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 海馬組織α7nAChR、AChE 蛋白的檢測(cè) 各組8 只，取-80℃保存海馬組織，冰上勻漿，加入放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液冰上孵育20 min，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清，測(cè)定總蛋白含量。取待測(cè)蛋白40 μg與等量上樣緩沖液混勻，100℃水浴變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離[9]，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用TBST洗滌后加入1∶400稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST 再次洗滌，加入1∶2 000 稀釋的二抗，37℃孵育1.5 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯影，蛋白相對(duì)表達(dá)量以α7nAChR、AChE與內(nèi)參β-actin 的灰度值比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依托咪酯對(duì)新生大鼠認(rèn)知功能的影響

新生大鼠麻醉清醒后2 h，對(duì)照組、依托咪酯組、激動(dòng)劑組洞板實(shí)驗(yàn)探洞次數(shù)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：依托咪酯組少于對(duì)照組和激動(dòng)劑組（P＜0.05）。3 組Y 電迷宮實(shí)驗(yàn)中正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時(shí)間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組大鼠麻醉清醒后2 h認(rèn)知功能比較 （n=8，±s）

表2 3組大鼠麻醉清醒后2 h認(rèn)知功能比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與依托咪酯組比較，P ＜0.05。

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新生大鼠麻醉清醒后4 周，對(duì)照組、依托咪酯組、激動(dòng)劑組洞板實(shí)驗(yàn)探洞次數(shù)、Y 電迷宮實(shí)驗(yàn)中正確反應(yīng)次數(shù)及全天總反應(yīng)時(shí)間比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組大鼠麻醉清醒后4周遠(yuǎn)期認(rèn)知功能比較（n=8，±s）

表3 3組大鼠麻醉清醒后4周遠(yuǎn)期認(rèn)知功能比較（n=8，±s）

組別對(duì)照組洞板實(shí)驗(yàn)探洞次數(shù)17.35±2.26 Y電迷宮實(shí)驗(yàn)正確反應(yīng)次數(shù)14.51±3.63全天總反應(yīng)時(shí)間/s 64.94±10.98依托咪酯組激動(dòng)劑組F 值P 值16.47±3.45 18.52±2.87 0.690 0.513 14.17±3.94 15.20±4.18 0.118 0.889 65.82±9.60 63.49±10.19 0.104 0.902

2.2 依托咪酯對(duì)海馬組織α7nAChR、AChE mRNA表達(dá)的影響

新生大鼠麻醉清醒后2 h，對(duì)照組、依托咪酯組、激動(dòng)劑組海馬組織α7nAChR、AChE mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：依托咪酯組海馬組織α7nAChR mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和激動(dòng)劑組（P＜0.05），AChE mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和激動(dòng)劑組（P＜0.05）。新生大鼠麻醉清醒后4 周，3 組α7nAChR、AChE mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表4 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與依托咪酯組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組α7nAChR mRNA 2 h 1.11±0.11 4周1.15±0.12 AChE mRNA 2 h 0.71±0.09 4周0.92±0.10依托咪酯組激動(dòng)劑組F 值P 值0.46±0.07①0.87±0.09②117.567 0.000 1.09±0.11 1.13±0.12 0.263 0.771 1.14±0.13①0.88±0.09②41.895 0.000 0.98±0.11 0.91±0.12 1.058 0.365

2.3 依托咪酯對(duì)海馬組織α7nAChR、AChE 蛋白表達(dá)的影響

新生大鼠麻醉清醒后2 h，對(duì)照組、依托咪酯組、激動(dòng)劑組海馬組織α7nAChR、AChE 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：依托咪酯組海馬組織α7nAChR 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和激動(dòng)劑組（P＜0.05），AChE 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和激動(dòng)劑組（P＜0.05）。新生大鼠麻醉清醒后4 周，3 組α7nAChR、AChE 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5和圖1。

表5 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表5 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與依托咪酯組比較，P ＜0.05。

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圖1 3組大鼠海馬組織α7nAChR、AChE蛋白的表達(dá)

3 討論

依托咪酯是咪唑類衍生物，屬于非巴比妥類短效麻醉藥，具有起效快、無(wú)明顯呼吸抑制、恢復(fù)迅速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于臨床麻醉及麻醉誘導(dǎo)[10]。有研究顯示，依托咪酯用于胃癌根治術(shù)、老年骨折手術(shù)的麻醉對(duì)認(rèn)知功能影響較小，同時(shí)有利于穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)[11-12]。本研究以7 d 齡新生大鼠（相當(dāng)于人類1 歲內(nèi)嬰幼兒）為研究對(duì)象，觀察依托咪酯暴露后對(duì)認(rèn)知功能的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，麻醉清醒后2 h，依托咪酯組洞板實(shí)驗(yàn)探洞次數(shù)減少，Y 電迷宮實(shí)驗(yàn)中正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時(shí)間無(wú)明顯變化。麻醉清醒后4 周，依托咪酯組洞板實(shí)驗(yàn)探洞次數(shù)、Y 電迷宮實(shí)驗(yàn)中正確反應(yīng)次數(shù)和全天總反應(yīng)時(shí)間無(wú)明顯變化，說(shuō)明依托咪酯暴露可影響一過(guò)性影響新生大鼠近期探索能力，對(duì)近期學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯影響。依托咪酯屬于咪唑類全身麻醉藥，作用時(shí)間短，對(duì)循環(huán)呼吸及血流動(dòng)力學(xué)影響小，在臨床中多用于老年患者，尤其是血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定、危重癥患者[13]。有研究顯示，依托咪酯用于老年患者骨折術(shù)中麻醉誘導(dǎo)和維持，血清皮質(zhì)醇和氧化應(yīng)激水平得到改善，手術(shù)前后認(rèn)知功能無(wú)變化[14]。

此外，本研究中新生大鼠麻醉清醒后2 h，依托咪酯組海馬組織α7nAChR mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，AChE mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；麻醉清醒后4 周，α7nAChR、AChE mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化，提示依托咪酯暴露可一過(guò)性下調(diào)α7nAChR，上調(diào)AChE 的表達(dá)。nAChR 屬于配體門控離子通道蛋白，分布于神經(jīng)元突觸及軸突區(qū)域，包括神經(jīng)型和肌肉型，其中神經(jīng)型nAChR 功能復(fù)雜多樣，與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，如隨意運(yùn)動(dòng)、記憶、情緒等關(guān)系密切[15-16]。nAChR 參與機(jī)體多種受體功能調(diào)節(jié)過(guò)程，且具有神經(jīng)保護(hù)作用。左紅艷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，微波輻射暴露可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能損傷，證實(shí)與海馬組織中nAChR 代謝紊亂有關(guān)。α7nAChR 是nAChR 的亞型之一，高表達(dá)于海馬和皮層組織中，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放及突觸的可塑性調(diào)節(jié)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病患者存在α7nAChR 異常低表達(dá)、nAChR 代謝紊亂現(xiàn)象，推測(cè)與認(rèn)知功能下降有關(guān)[18-19]。本研究采用α7nAChR 激動(dòng)劑PNU-282987 干預(yù)后，新生大鼠麻醉清醒后2 h，與依托咪酯組比較，激動(dòng)劑組洞板實(shí)驗(yàn)探洞次數(shù)增加，α7nAChR mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，AChE mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低；而麻醉清醒后4 周洞板實(shí)驗(yàn)、Y 電迷宮實(shí)驗(yàn)及α7nAChR、AChE mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化，提示依托咪酯暴露對(duì)新生大鼠探索能力的一過(guò)性影響，可能是通過(guò)抑制海馬nAChR 功能實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，新生大鼠咪酯麻醉對(duì)近期學(xué)習(xí)記憶能力和遠(yuǎn)期認(rèn)知能力無(wú)明顯影響，但可一過(guò)性影響新生大鼠近期探索能力，可能與抑制海馬nAChR 功能有關(guān)。在進(jìn)一步研究中將研究依托咪酯暴露是否能通過(guò)其他信號(hào)通路對(duì)新生大鼠近期探索能力產(chǎn)生影響，為臨床使用咪酯麻醉提供理論參考。