陳民彪，黃明芳，廖緒強，蔡仁中

（海南省人民醫(yī)院 胸外科，海南 ?？?70311）

隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的變化，食管癌發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢[1]。食管癌是一種起源于食管鱗狀上皮和柱狀上皮的惡性腫瘤，其發(fā)生與遺傳、環(huán)境等多種因素有關(guān)[2]，具體病因尚未完全明確。細(xì)胞周期失控及異常增殖是腫瘤發(fā)生的重要機制之一。染色體縮合調(diào)節(jié)因子2（regulator of chromosome condensation 2, RCC2）是染色體乘客復(fù)合體的重要組成部分，與多種增殖及凋亡抑制基因共同作用，參與細(xì)胞增殖過程[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，RCC2 靶向調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y 框蛋白2（sex determining region Y-box 2, SOX2）參與胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但該通路在食管癌中的作用報道較少[4]。SOX2 是一種可調(diào)節(jié)胚胎和組織發(fā)育的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，多項研究發(fā)現(xiàn)其在食管癌中表達上調(diào)[5-6]，但是否受到RCC2 的調(diào)控尚不明確。本研究探討RCC2 在食管癌小鼠細(xì)胞中的表達，并分析其是否能靶向調(diào)控SOX2，影響食管癌細(xì)胞的增殖，以期為臨床治療提供新靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取6～8 周齡雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠30 只，購自湖南省動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2017-0008 號，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2017-0167。體質(zhì)量180～200 g，飼養(yǎng)溫度22～24℃，每日給予充足動物飼料及飲水。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑及儀器

RCC2 mimics、RCC2 inhibitor 及對應(yīng)陰性對照質(zhì)粒購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Gibco 公司），青鏈霉素（美國Invirogen 公司），胰酶（福建基諾生物科技有限公司），RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司），RNA 提取試劑盒（美國Merck & Co Inc），PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），鼠抗人RCC2、SOX2、PCNA、Snail 單克隆抗體及兔抗鼠二抗購自美國Sigma 公司，CCK-8 試劑盒（武漢默沙克生物有限公司）。Transwell 小室（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司），酶標(biāo)儀（美國邁瑞MR-96A 型），T100 型PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司），371 型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.3 方法

1.3.1 食管癌小鼠模型的復(fù)制及細(xì)胞提取 小鼠每日飲用100 g/L 4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline-1-oxide, 4-NQO）滅菌水（配制方法：將4-NQO溶解于1，2-丙二醇，配制成為5 g/L 質(zhì)量濃度的溶液，再加入高壓滅菌水進一步稀釋成100 g/L 質(zhì)量濃度的溶液），連續(xù)喂養(yǎng)10 周后改飲用滅菌水喂養(yǎng)至18 周，觀察小鼠進食、飲水情況及毛色變化，并監(jiān)測小鼠體質(zhì)量。第18 周時采用頸椎脫臼法處死小鼠，打開胸腔取出食管組織。剪碎食管組織，37℃水浴條件下加入胰酶消化10 min，反復(fù)操作3 次，細(xì)胞混合液3 000 r/min 離心5 min，取上層細(xì)胞懸液，PBS 洗滌，在含10%胎牛血清的DMEM/F12 中重懸，接種在培養(yǎng)皿，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察到上皮樣形態(tài)，鑒定為食管癌細(xì)胞后，在培養(yǎng)箱中進一步培養(yǎng)、傳代，采用第3 代細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及培養(yǎng) 將提取的食管癌細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將RCC2 mimics、RCC2 inhibitor 或mimics-NC、inhibitor-NC 對照序列轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，并分別作為RCC2 mimics 組、RCC2 inhibitor組、mimics-NC 組、inhibitor-NC 組。另選未處理的食管癌細(xì)胞作為對照組，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育48 h。

1.3.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時，各組分別加入10 μl CCK-8 試劑，37℃避光孵育2 h，以空白孔調(diào)零，加入150 μl DMSO 溶解，測定450 nm 處吸光度值，以O(shè)D 值反映細(xì)胞增殖能力。每組重復(fù)操作3 次，取平均值。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）檢 測RCC2、SOX2、PCNA、Snail mRNA 相對表達量 采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并測定樣品濃度，確定合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，74℃延伸30 s，共40 個循環(huán)，記錄每個基因的Ct 值，目的基因相對表達量以2-△△Ct表示。引物序列由上海生工生物工程有限公司提供，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.5 Western blotting 檢測RCC2、SOX2、PCNA、Snail 蛋白相對表達量 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后去除培養(yǎng)液，PBS 洗滌，加入細(xì)胞裂解液，3 000 r/min 離心5 min，取上清液。采用SDA-PAGE 檢測細(xì)胞目的蛋白相對表達量，配置膠體，制備蛋白樣品，上樣（蛋白樣品和Maker），電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加一抗、二抗孵育，洗膜，顯影，標(biāo)記獲得的蛋白條帶，采用Image Lab 軟件測定蛋白條帶灰度值，并計算目的蛋白相對表達量。

1.3.6 熒光素酶實驗 按照熒光素酶試劑盒說明書進行操作，將細(xì)胞按2×105個/孔的密度接種到12 孔板中，共轉(zhuǎn)染RCC2、SOX2。將SOX2 野生型、突變型質(zhì)粒分別與RCC2 mimics、mimics-NC 共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞（分別作為RCC2 和野生型SOX2-wt 共轉(zhuǎn)染組、突變型SOX2-mut 共轉(zhuǎn)染組），培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)液后PBS 洗滌，加入細(xì)胞裂解液，在4℃條件下 震 蕩10 min，40℃、1 000 r/min 離心3 min，取上清液進行發(fā)光檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組和對照組RCC2的表達

實驗組和對照組RCC2 mRNA 相對表達量分別為（1.48±0.35）和（1.06±0.22），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.254，P=0.029），實驗組高于對照組。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況

RCC2 mimics 組、mimics-NC 組、RCC2 inhibitor組、inhibitor-NC 組、對照組細(xì)胞培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h 時增殖情況比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果顯示：①不同時間點細(xì)胞增殖有差異（F=103.803，P=0.000）；②各組細(xì)胞增殖有差異（F=13.012，P=0.000）；③各組細(xì)胞增殖變化趨勢有差異（F=56.475，P=0.000）。0 h、24 h 時各組細(xì)胞增殖無明顯差異（P＞0.05）。48 h、72 h 時，與對照組比較，RCC2 inhibitor 組細(xì)胞增殖減少（P＜0.05），其余各組增加（P＜0.05）；與對應(yīng)陰性對照組比較，RCC2 mimic 組細(xì)胞增殖增加（P＜0.05），RCC2 inhibitor 組細(xì)胞增殖減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組不同時間點細(xì)胞增殖比較 （n=6，±s）

表2 各組不同時間點細(xì)胞增殖比較 （n=6，±s）

組別RCC2 mimic組mimic-NC組RCC2 inhibitor組inhibitor-NC組對照組0 h 0.14±0.03 0.16±0.04 0.13±0.02 0.15±0.03 0.14±0.05 24 h 0.37±0.06 0.34±0.07 0.30±0.05 0.35±0.07 0.36±0.04 48 h 1.26±0.11 0.81±0.09 0.47±0.06 0.84±0.09 0.74±0.08 72 h 1.84±0.20 1.26±0.14 0.53±0.07 1.23±0.15 1.15±0.13

2.3 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail mRNA相對表達量

RCC2 mimics 組、mimics-NC 組、RCC2 inhibitor組、inhibitor-NC 組、對照組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail mRNA 相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：對照組低于RCC2 mimics 組、mimics-NC 組、inhibitor-NC 組（P＜0.05）；與對應(yīng)陰性對照組 比 較，RCC2 mimic 組升高（P＜0.05），RCC2 inhibitor 組降低（P＜0.05）。見表3 和圖1。

圖1 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail mRNA相對表達量比較 （n=6，±s）

表3 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail mRNA相對表達量比較 （n=6，±s）

表3 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail mRNA相對表達量比較 （n=6，±s）

組別RCC2 mimic組mimic-NC組RCC2 inhibitor組inhibitor-NC組對照組F 值P 值RCC2 mRNA 1.41±0.39 1.12±0.34 0.23±0.05 1.09±0.23 1.05±0.34 67.020 0.000 SOX2 mRNA 2.34±0.78 1.45±0.32 0.26±0.07 1.42±0.30 1.38±0.39 83.541 0.000 PCNA mRNA 1.28±0.32 1.04±0.24 0.19±0.06 1.01±0.26 0.96±0.35 42.650 0.000 Snail mRNA 1.56±0.42 1.12±0.25 0.27±0.04 1.09±0.23 1.01±0.20 51.203 0.000

2.4 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail 蛋白相對表達量

RCC2 mimics 組、mimics-NC 組、RCC2 inhibitor組、inhibitor-NC 組、對照組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail 蛋白相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：對照組低于RCC2 mimics 組、 mimics-NC 組、inhibitor-NC 組（P＜0.05）；與對應(yīng)陰性對照組比較，RCC2 mimic 組升高（P＜0.05），RCC2 inhibitor 組降低（P＜0.05）。見表4 和圖2、3。

表4 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

表4 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

組別RCC2 mimic組mimic-NC組RCC2 inhibitor組inhibitor-NC組對照組F 值P 值RCC2蛋白1.52±0.35 1.24±0.26 0.26±0.05 1.21±0.28 1.15±0.22 107.231 0.000 SOX2蛋白2.36±0.72 1.52±0.23 0.24±0.04 1.49±0.26 1.28±0.22 63.574 0.000 PCNA蛋白1.43±0.26 0.94±0.17 0.14±0.03 0.97±0.15 0.91±0.24 30.621 0.000 Snail蛋白1.62±0.43 0.58±0.07 0.20±0.05 0.62±0.08 0.49±0.06 78.174 0.000

圖2 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

圖3 各組細(xì)胞RCC2、SOX2、PCNA、Snail蛋白的表達

2.5 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較

熒光素酶實驗結(jié)果顯示，mimics-NC 組、RCC2和野生型SOX2-wt 共轉(zhuǎn)染組、突變型SOX2-mut 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性分別為（0.98±0.13）、（1.27±0.24）和（0.91±0.17），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.610，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：與mimics-NC 組比較，RCC2 和野生型SOX2-wt 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性升高（t=5.819，P=0.000）；而mimics-NC 組與突變型SOX2-mut 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.792，P=0.078）。

3 討論

食管癌是多因素、多基因共同作用的結(jié)果，病因和發(fā)病機制復(fù)雜。近年來，細(xì)胞周期及相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)蛋白在癌癥方面的研究逐漸成為熱點。大量研究顯示，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的功能缺陷在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用[7]。RCC2 是一種通過相關(guān)信號通路參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白，目前發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮作用，如沉默RCC2 表達后，胃癌細(xì)胞增殖能力受到抑制[8]。RCC2 可通過MAPK/JNK 信號通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞遷移，參與結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化（epithelial mesenchymal transition, EMT） 過程[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，RCC2 在乳腺癌細(xì)胞中表達上調(diào)，且能作用于整聯(lián)蛋白黏附復(fù)合物參與細(xì)胞遷移，提示RCC2 在細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)過程中起到一定作用[10]。本研究結(jié)果表明，食管癌小鼠食管組織中RCC2 表達高于正常小鼠，提示RCC2 在食管癌中表達上調(diào)。過表達RCC2 后細(xì)胞增殖增加，抑制RCC2 表達后細(xì)胞增殖減少，提示RCC2 可能通過調(diào)控細(xì)胞周期，參與食管癌細(xì)胞增殖。

SOX2 是轉(zhuǎn)錄因子SOX 家族的成員，與靶基因HMG結(jié)構(gòu)域結(jié)合，參與調(diào)控胚胎發(fā)育、維持細(xì)胞的干性和自我更新等過程[11]。上皮來源的惡性腫瘤，如食管癌、肺癌、口腔癌、皮膚癌等，均可見SOX2 表達上調(diào)，提示SOX2 可能與腫瘤EMT 過程有關(guān)[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，SOX2 通過調(diào)控胃癌細(xì)胞周期，阻滯細(xì)胞凋亡，從而影響胃上皮細(xì)胞的生長，并與胃癌臨床預(yù)后不良有關(guān)[13]，提示SOX2可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，參與腫瘤進展。目前發(fā)現(xiàn)SOX2 的啟動子區(qū)與PCNA、Snail 存在多個結(jié)合位點，其中PCNA 是一種DNA 聚合酶的輔助蛋白，在細(xì)胞DNA 復(fù)制過程不可或缺，其在細(xì)胞靜止期表達水平較低，G1 期開始增加，S 期達到峰值，隨后G2 期明顯下降，因此其表達水平能有效評價腫瘤細(xì)胞DNA 合成狀態(tài)和細(xì)胞增殖動力水平[14]。MO 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SOX2 能通過調(diào)控同樣為轉(zhuǎn)錄因子的Snail，參與食管鱗癌的惡化。還有研究發(fā)現(xiàn)，抑制SOX2 表達后，胃癌細(xì)胞增殖能力受限，PCNA 蛋白表達水平明顯下降[16]。與SOX2 相同的是，Snail 也是一種轉(zhuǎn)錄因子，是最早發(fā)現(xiàn)的Snail 超家族成員，在食管癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)[17]。Snail 是腫瘤細(xì)胞EMT過程的標(biāo)志物之一，與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SOX2 能分別靶向作用PCNA、Snail，增強小鼠成瘤能力，促進食管癌細(xì)胞的增殖和自我更新[18]。本研究結(jié)果表明，RCC2 與SOX2 具有靶向調(diào)控作用。過表達RCC2 后，細(xì)胞中SOX2及SOX2 靶基因PCNA、Snail 相對表達量均明顯升高，反之降低，提示RCC2 可靶向調(diào)控SOX2 及其靶基因，從而促進食管癌細(xì)胞增殖。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中RCC2 過表達可抑制SOX2 泛素化過程，促進SOX2 與其靶基因啟動子區(qū)結(jié)合，增強SOX2 轉(zhuǎn)錄活性[19]。還有研究認(rèn)為，在RCC2 沉默的肺癌細(xì)胞中過表達SOX2 能正向調(diào)控細(xì)胞存活，拮抗RCC2 沉默對細(xì)胞增殖的抑制作用[20]，這可能是RCC2 通過調(diào)控SOX2 的表達，促進腫瘤細(xì)胞增殖的原因之一。

綜上所述，RCC2、SOX2 在食管癌細(xì)胞中均呈高表達，且RCC2 能通過上調(diào)SOX2 及其靶基因的表達，提高食管癌小鼠細(xì)胞增殖能力，進一步對食管癌的進展產(chǎn)生影響。但RCC2 調(diào)節(jié)信號通路眾多，可能有多種信號通路參與食管癌細(xì)胞增殖過程，且目前尚不清楚SOX2 與RCC2 靶基因啟動子區(qū)結(jié)合的作用機制。