都?jí)舴?，胥冰，向汝，郭東艷，范妤，史曉燕，段麗芳

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)1.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712046）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease, ALD）指攝入過(guò)量酒精引起的廣泛肝損傷，導(dǎo)致酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化等一系列肝臟損傷的疾病[1]，隨著持續(xù)大量攝入酒精而逐級(jí)病變。目前ALD 發(fā)病率在肝臟疾病中排第2 位，僅次于病毒性肝炎，隨著疾病的進(jìn)展會(huì)逐漸發(fā)展為不可逆的肝硬化，甚至肝癌，嚴(yán)重威脅患者的健康[2]。酒精性肝損傷目前沒(méi)有較好的臨床治療策略，西醫(yī)主要以營(yíng)養(yǎng)支持和對(duì)癥治療為主，療效甚微，不良反應(yīng)較多[3]。我國(guó)傳統(tǒng)中藥可保肝護(hù)肝、健脾和胃、降低轉(zhuǎn)氨酶、加快乙醇代謝，還能逆轉(zhuǎn)酒精導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷，減輕酒精代謝物對(duì)臟器的損傷[4]，因此從中草藥中提取有效成分，探尋預(yù)防和治療酒精性肝損傷的新藥物具有重要意義。

苦參堿是一種四環(huán)喹啉嗪生物堿[5]，主要存在于苦參、廣豆根、苦豆子等豆科植物中，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗纖維化等藥理作用[6]，目前臨床上主要用于輔助其他藥物對(duì)病毒性肝炎和腫瘤等疾病進(jìn)行治療[7]。有研究表明苦參堿可調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，協(xié)同保護(hù)潰瘍性結(jié)腸炎和肺損傷[8]?？鄥A可明顯改善四氯化碳誘導(dǎo)的藥物性肝損傷，增強(qiáng)抗氧化物酶，減少肝損傷產(chǎn)生高氨血癥引起的氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥，減少四氯化碳誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起的焦慮和抑郁等[9]。但其在酒精性肝損傷中的保護(hù)作用還不清楚。因此本文主要針對(duì)苦參堿在酒精性肝損傷中的抗氧化作用進(jìn)行研究，探究苦參堿的肝保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性昆明小鼠30 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（陜）2015-002，體重（20±2）g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠分籠飼養(yǎng)，室溫保持（20±3）℃，模擬正常光照時(shí)間，普通飼料喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自山東瑞陽(yáng)制藥股份有限公司，溶解于葡萄糖溶液后參照成人用量折算，按比例分別制成高劑量組（2.8 mg/kg）、低劑量組（1.4 mg/kg）。

丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、還原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）、過(guò)氧化氫酶（Catalase, CAT）、甘油三酯（Triglyceride, TG）測(cè)定試劑盒，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）試劑盒、總膽紅素（total bilirubin, T-BIL）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。BCA 蛋白定量檢測(cè)試盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，油紅O 染色試劑盒購(gòu)自西安赫特生物科技有限公司，HE 染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DM4000B 顯微鏡、石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica 公司，ELx808 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek 公司，TC-120S 型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、TB-718EL 生物組織包埋機(jī)、TK-218II 生物組織攤片、烤片機(jī)購(gòu)自湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，Centrifuge 5417R 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組與藥物干預(yù) 將30 只小鼠根據(jù)隨機(jī)分類法分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯滴丸125 mg/kg）、苦參堿高劑量組（苦參堿注射液2.8 mg/kg）、苦參堿低劑量組（苦參堿注射液1.4 mg/kg）。各組按照10 ml/（kg·d）劑量進(jìn)行尾靜脈注射，空白組和模型組注射同等劑量的葡萄糖溶液。實(shí)驗(yàn)期間不限進(jìn)食和飲水，連續(xù)給藥14 d，末次給藥12 h 后，除空白組外，其余各組按12 ml/kg一次性灌胃50%乙醇，復(fù)制急性酒精性肝損傷模型，16 h 后取血和肝臟。

1.4.2 一般形態(tài)觀察 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察小鼠的體重變化、進(jìn)食、飲水、毛發(fā)、精神狀態(tài)、行為及死亡情況，有任何異常情況及時(shí)記錄。

1.4.3 肝指數(shù)測(cè)定 4℃生理鹽水漂洗肝臟，吸干水分后稱重。肝臟指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/小鼠體重（g）×100%

1.4.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 血液樣品靜置2 h，冷凍離心機(jī)4℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液用于檢測(cè)血清ALT、AST 和T-BIL。

1.4.5 肝組織的病理切片觀察 肝左葉最大橫截面取2～3 mm，經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，按照蘇木精-伊紅染色試劑盒步驟染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織的病理變化。

1.4.6 肝組織相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 取適量肝組織樣本，加入10 倍預(yù)冷生理鹽水，研磨后制備成10%的組織勻漿，4℃條件下3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液，進(jìn)行蛋白定量后檢測(cè)MDA、TG、SOD、CAT、GSH 水平。

1.4.7 肝細(xì)胞脂滴沉積分析 取OCT 包埋膠固定的肝組織，用冷凍切片機(jī)-20℃切至10 μm，切片用10%的中性甲醛固定，60%異丙醇漂洗，經(jīng)油紅O 滴染、漂洗、復(fù)染后，甘油封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝組織脂滴分布。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件半定量測(cè)定脂滴的平均光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝臟指數(shù)的變化

空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組肝指數(shù)分別為（5.01±0.34）% 、（5.91±0.24）% 、（5.29±0.54）% 、（5.41±0.40）%和（5.51±0.25）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.904，P=0.001），模型組較空白組增加（P＜0.05），苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組較模型組降低（P＜0.05）。

2.2 各組血清ALT、AST、T-BIL水平的變化

各組血清AST、ALT、T-BIL 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組較空白組升高（P＜0.05），提示小鼠肝損傷模型復(fù)制成功。陽(yáng)性對(duì)照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組較模型組降低（P＜0.05），提示苦參堿預(yù)處理可改善急性肝損傷小鼠模型的ALT、AST、T-BIL 活性。見(jiàn)表1。

表1 各組血清AST、ALT、T-BIL水平比較（n=6，±s）

表1 各組血清AST、ALT、T-BIL水平比較（n=6，±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性對(duì)照組苦參堿高劑量組苦參堿低劑量組F 值P 值A(chǔ)ST/（u/L）54.38±7.58 166.98±20.37 60.43±8.33 88.25±13.31 109.17±15.81 10.017 0.001 ALT/（u/L）27.43±3.06 41.34±5.48 31.71±4.13 32.48±5.35 35.04±4.03 4.307 0.024 T-BIL/（μmol/L）2.92±1.11 38.84±10.14 13.80±8.96 22.77±7.96 25.18±5.48 16.356 0.000

2.3 各組肝組織病理學(xué)變化

空白組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列清晰整齊，無(wú)肝細(xì)胞變性、壞死，未見(jiàn)脂肪變性。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝索雜亂排列，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝實(shí)質(zhì)間出現(xiàn)大量細(xì)胞空洞，核固縮深染，肝細(xì)胞水腫，出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性和氣球樣變性?？鄥A低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組較模型組稍有好轉(zhuǎn)，苦參堿高劑量組肝臟形態(tài)趨于完整，無(wú)明顯空洞，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，少量核固縮深染，未見(jiàn)明顯水腫和脂肪變性。見(jiàn)圖1。

圖1 苦參堿對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響 （HE染色×100）

2.4 各組肝組織抗氧化能力的變化

各組肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH、CAT、TG 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組SOD、GSH、CAT 較空白組降低（P＜0.05），MDA、TG 較空白組升高（P＜0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組、苦參堿高劑量組的GSH、CAT、SOD 較模型組升高（P＜0.05），MDA、TG 較模型組降低（P＜0.05）。低劑量苦參堿預(yù)處理可提高GSH、CAT 水平，抑制肝臟中TG 水平，但模型組與苦參堿低劑量組SOD、MDA 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組肝組織SOD、MDA、GSH、CAT、TG相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

表2 各組肝組織SOD、MDA、GSH、CAT、TG相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性對(duì)照組苦參堿高劑量組苦參堿低劑量組F 值P 值SOD/（u/mg）0.26±0.02 0.16±0.04 0.23±0.05 0.24±0.03 0.20±0.03 6.025 0.007 MDA/（nmol/mg）0.76±0.10 1.13±0.25 0.83±0.18 0.86±0.16 0.93±0.22 4.002 0.025 GSH/（g/L）1.87±0.20 1.30±0.24 1.63±0.26 1.73±0.30 1.65±0.26 4.539 0.021 CAT/（u/mg）1.18±0.06 0.87±0.10 1.04±0.05 1.12±0.04 1.00±0.07 5.212 0.010 TG/（mmol/L）0.13±0.02 0.29±0.05 0.16±0.05 0.19±0.03 0.20±0.04 3.691 0.032

2.5 苦參堿對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織脂滴沉積的影響

油紅O 染色結(jié)果顯示：空白組小鼠肝臟細(xì)胞中存在少量、小體積、分布均勻的橘紅色小脂滴。模型組小鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)彌漫性、大小不一的橘紅色脂滴，相鄰肝細(xì)胞內(nèi)脂滴融合，且較空白組體積增大。陽(yáng)性對(duì)照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴較模型組數(shù)量減少，體積減小，差異顯著（見(jiàn)圖2）。計(jì)算脂滴光密度后結(jié)果顯示：空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組肝臟脂滴光密度分別為（4.08±0.42）、（7.09±1.59）、（5.84±0.47）、（4.15±0.94）、（4.50±0.39），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.888，P=0.000）。模型組較空白組增加（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組、苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組較模型組減少（P＜0.05）。

圖2 苦參堿對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響 （油紅O染色×200）

3 討論

ALD 的病理機(jī)制涉及廣泛，與線粒體功能障礙、脂質(zhì)過(guò)氧化、腸源性內(nèi)毒素血癥、Kupffer 細(xì)胞活化、免疫系統(tǒng)及肝炎病毒等有關(guān)[10-11]。此外，近年來(lái)有研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)在酒精性肝損傷中起到重要的推動(dòng)作用[12-13]。苦參堿具有多種藥理作用，臨床上主要用于治療病毒性肝炎、慢性肝纖維化以及惡性腫瘤的輔助治療[14]。柴寧莉等[15]發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿具有抗癌作用，可下調(diào)肝癌干性基因，抑制肝癌細(xì)胞的增殖[16]。此外，苦參堿對(duì)APAP 所致的藥物性肝損傷具有保護(hù)作用[17]，但其在酒精性肝損傷中的作用仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討苦參堿在酒精性肝損傷中的抗氧化作用。

肝臟是進(jìn)行酒精代謝的主要器官，ALT 和AST作為肝細(xì)胞漿內(nèi)的兩種可溶性酶，在酒精代謝中起到重要作用。肝細(xì)胞受損后，細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致大量可溶性酶進(jìn)入血液，因此ALT 和AST 可作為肝臟損傷的敏感指標(biāo)[18]，能反映肝細(xì)胞的損傷程度。本研究中模型組小鼠的ALT、AST 和T-BIL 明顯高于空白組，提示急性肝損傷模型復(fù)制成功，而苦參堿注射液各治療組ALT、AST、T-BIL較模型組明顯下降，且隨著劑量因素比重的增大，抑制作用更明顯。說(shuō)明苦參堿注射液預(yù)處理能穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，抑制因肝細(xì)胞破裂、壞死而引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，保護(hù)肝細(xì)胞免于大量酒精攝入引起的損傷。

肝臟內(nèi)TG 的積累是機(jī)體對(duì)乙醇消耗的重要反應(yīng)之一，也是肝臟脂肪變性的重要特征。與空白組相比，模型組TG 水平升高，苦參堿預(yù)處理可降低肝臟中TG 水平，且隨著劑量因素比重的增加，抑制作用更明顯。油紅O 是一種偶氮染料，可特異性的與組織中的TG 等中性脂肪結(jié)合呈小脂滴狀并著色，組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色[19]。本研究油紅O 染色結(jié)果顯示經(jīng)苦參堿預(yù)處理后，小鼠肝組織中的脂滴較模型組下降，表明苦參堿可有效抑制酒精引起的小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，抑制肝臟中脂肪過(guò)度沉積，減少脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

氧化應(yīng)激指機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，造成體內(nèi)多種分子的氧化或硝化損傷，降低清除自由基的能力，損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA[20]。過(guò)量的ROS 可激活肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA 和其他脂質(zhì)過(guò)氧化物大量生成，這可能破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞的腫脹和壞死[9]。MDA 作為不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成的終末產(chǎn)物之一，可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其水平可反映自由基產(chǎn)生的強(qiáng)度，體現(xiàn)機(jī)體損傷的程度[21]。模型組小鼠肝組織勻漿中MDA 顯著增加，表明其肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化受損嚴(yán)重，而苦參堿可拮抗酒精攝入引起的氧化損傷。SOD、GSH、CAT 是體內(nèi)重要的抗氧化酶和非酶抗氧化劑，可直接或間接清除氧自由基，及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞[22]。與模型組比較，苦參堿高劑量組的SOD、GSH、CAT 水平明顯提高，表明苦參堿可提高機(jī)體抗氧化能力，清除自由基，改善肝損傷。