李晨馳，韓蕭蕭，楊柳，張景允，劉冉陽，楊勤

（貴州醫(yī)科大學1.病理生理學教研室，2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，貴州 貴陽550000）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）指除酒精和其他明確損傷肝臟的因素之外，發(fā)生的以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要病理特征的臨床病理綜合征[1]。目前研究認為，在一定程度上，肝臟脂肪變性是有可能逆轉(zhuǎn)的；而一旦進展為肝炎、肝纖維化，治療難度將會增大。因此，近年來許多研究都致力于通過不同的手段，包括食療、藥物等改善NAFLD[2]。本課題組前期研究及其他學者的研究發(fā)現(xiàn)，藍莓具有一定的預防和改善脂肪肝的作用，這為NAFLD 的非藥物療法提供了新思路，但其機制尚未完全闡明[3-4]。

脂滴包被蛋白5（Perilipin5, Plin5）是Perilipin 家族的最新成員。已有研究顯示，Plin5 作為脂滴形成的關(guān)鍵蛋白之一，在維持細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和代謝平衡中具有重要作用[5]，且Plin5 的表達受PI3K/Akt 信號通路的影響[6]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，富含黃酮類化合物的碧蘿芷能夠影響油酸誘導的Plin5蛋白表達[7]，而藍莓中含有大量黃酮類化合物——花青素[8]。由此推測藍莓改善肝脂肪變性的作用可能與藍莓富含的花青素調(diào)節(jié)肝細胞Plin5 蛋白的表達有關(guān)。

故本研究以油酸（oleic acid, OA）誘導AML12 小鼠肝細胞發(fā)生脂肪變性，復制NAFLD 模型，在此基礎(chǔ)上觀察藍莓花青素對油酸誘導的肝細胞脂肪變性及損傷是否具有改善作用，并觀察Plin5 蛋白表達與脂滴形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料與儀器

AML12 小鼠正常肝細胞株購自中國科學院干細胞庫，藍莓花青素購自陜西萃雅佳生物科技有限公司，油酸購自美國Sigma 公司，胎牛血清購自美國Scien Cell 公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國Gbico 公司，油紅O 細胞專用染色試劑盒購自北京Solarbio 公司， 甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗體購自武漢ABclonal 公司，Plin5 多克隆抗體購自美國Proteintech 公司， 磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）、磷酸化蛋白激酶（phospho-protein kinase B, Akt）抗體購自美國CST 公司，甘油三酯（Triglyceride, TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司，xCELLigence RTCA DP 型實時無標記細胞分析儀（real time cellular analysis,RTCA）購自杭州艾森生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最佳藍莓花青素終濃度的確定 AML12 小鼠肝細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用實時無標記細胞分析技術(shù)檢測藍莓花青素對AML12 細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液進行計數(shù)，接種密度為5×103個/孔（150 μl/孔），設(shè)置3個復孔。接種細胞24 h后，以不同終濃度的藍莓花青素（0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml）培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別設(shè)置為0 μg/ml 組、50 μg/ml 組、100 μg/ml 組、150 μg/ml 組、200 μg/ml 組。連續(xù)動態(tài)監(jiān)測≥65 h，每15 min 記錄1 次。抑制率（%）=（0 μg/ml 組-不同濃度藍莓花青素組）/0 μg/ml 組×100%。根據(jù)實驗結(jié)果選擇對細胞生長抑制非常低的藍莓花青素濃度（50 μg/ml）作為后續(xù)實驗的干預濃度。

1.2.2 細胞分組及肝細胞脂肪變性模型復制 取對數(shù)生長期細胞，按照每孔1.25×105個/ml 細胞密度接種于6 孔板，分別設(shè)置對照組、油酸誘導組、維生素C 組、藍莓花青素組。對照組常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，油酸誘導組、維生素C 及藍莓花青素組，根據(jù)參考文獻[9]及預實驗結(jié)果，選擇含0.75 mmol/L 油酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，復制小鼠肝細胞脂肪變性模型。復制成功后，維生素C 組及藍莓花青素組分別更換含50 μg/ml 維生素C 及50μg/ml 藍莓花青素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集細胞，檢測各項指標。

1.2.3 ALT、AST、TG 水平檢測 細胞按照7.5×105個/ml 密度培養(yǎng)于直徑60 mm 培養(yǎng)皿。收集細胞培養(yǎng)液上清，根據(jù)試劑盒操作說明進行加樣，測定各孔光密度（OD）值。按照液體樣本計算公式：絕對OD 值=測定孔OD 值-對照孔OD 值，參考試劑盒標準曲線，檢測ALT、AST 活力單位。收集細胞，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，留細胞沉淀，分別加入等量PBS 清洗2 次。再次加入PBS，在冰浴條件下將細胞進行超聲破碎，制備好勻漿后不離心，按照操作表進行加樣，每組重復3 次，測定各孔OD 值。并以BCA 法測定蛋白濃度。按照細胞計算公式：TG 濃度=[（樣本OD 值-空白OD 值）/（校準OD 值-空白OD 值）]×校準品濃度（mmol/L）/待測樣本蛋白濃度（g/L），檢測細胞內(nèi)TG 含量。

1.2.4 油紅O染色 細胞按照每孔1.25×105個/ml密度培養(yǎng)于6 孔板。棄細胞培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定50 min 后PBS 漂洗，油紅O 染色1 h，60%異丙醇漂洗10 s，PBS 漂洗，染色。顯微鏡下拍照。采用ImageJ-ProPlus 6.0 圖像分析軟件，每組隨機選取3 個高倍視野，計算脂滴表達的紅色積分光密度（IOD）值。

1.2.5 Western blotting 細胞按照7.5×105個/ml 密度培養(yǎng)于直徑60 mm 培養(yǎng)皿。使用RIPA 蛋白裂解液裂解細胞，按照BCA 蛋白定量法計算并制備蛋白樣品，向蛋白液中加入5×SDS 蛋白上樣緩沖液，取10 μl 上樣并使用SDS-PAGE 分離后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉液封閉1.5 h。TBST 洗膜后，加入稀釋后的I 抗[Plin5 為1∶4 000，GAPDH為1∶2 000，PI3K為1∶1 000，P-Akt為1∶2 000]孵育，4℃過夜。次日用TBST 洗凈后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。之后使用ECL 工作液曝光。以IMAGELAB 軟件計算陰影值，Plin5、PI3K、P-Akt 與GAPDH 表達量陰影面積的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藍莓花青素對細胞增殖的影響

用不同濃度的藍莓花青素培養(yǎng)基處理后，0 μg/ml組和50 μg/ml 組的細胞指數(shù)逐漸升高，100 μg/ml、150 μg/ml 組緩慢升高，200 μg/ml 組緩慢升高后下降。0 μg/ml 組、50 μg/ml 組、100 μg/ml 組、150 μg/ml組、200 μg/ml 組細胞指數(shù)分別為（2.49±0.07）、（2.45±0.06）、（2.14±0.04）、（1.51±0.060）和（1.42±0.02），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=275.573，P=0.000），100 μ g/ml、150 μ g/ml、200 μ g/ml 組 較0 μg/ml 組下降（P＜0.05）。藍莓花青素處理24 h 后100 μg/ml 組抑制率為14.18%；而50 μg/ml 組 為1.60%，未顯示出明顯抑制率。因此選擇50 μg/ml的藍莓花青素作為后續(xù)實驗的干預濃度。見圖1。

圖1 不同濃度藍莓花青素處理AML12細胞的細胞指數(shù)變化趨勢

2.2 各組AML12細胞AST、ALT、TG水平比較

各組AML12 細胞ALT、AST、TG 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），油酸誘導組較對照組升高（P＜0.05），維生素C 組、藍莓花青素組較油酸誘導組降低（P＜0.05），藍莓花青素組較維生素C 組降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組AML12細胞AST、ALT、TG水平比較（±s）

表1 各組AML12細胞AST、ALT、TG水平比較（±s）

組別對照組油酸誘導組維生素C組藍莓花青素組F 值P 值A(chǔ)LT/（u/L）2.32±0.19 8.55±0.24 4.94±0.79 3.47±0.74 68.682 0.000 AST/（u/L）2.84±0.76 8.34±1.51 5.98±0.35 4.86±0.15 21.037 0.000 TG/（mmol/g）0.09±0.01 0.47±0.01 0.38±0.04 0.28±0.06 54.350 0.000

2.3 脂滴染色結(jié)果

對照組細胞幾乎沒有被油紅染料染成紅色的脂滴。油酸誘導組細胞胞質(zhì)內(nèi)有大量被油紅染料染成紅色的脂滴，并散在分布于細胞核周圍。維生素C 組、藍莓花青素組可見脂滴不同程度地減少。對照組、油酸誘導組、維生素C 組、藍莓花青素組的IOD 值分別為（0.04±0.04）、（4.00±0.20）、（2.63±0.21）、（1.17±0.15），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=329.990，P=0.000），油酸誘導組較對照組升高（P＜0.05），維生素C 組、藍莓花青素組較油酸誘導組降低（P＜0.05），藍莓花青素組較維生素C 組降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組AML12細胞中脂滴分布 （油紅O染色）

2.4 各組Plin5、PI3K、P-Akt蛋白相對表達量比較

各組Plin5、PI3K、P-Akt 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。油酸誘導組較對照組升高（P＜0.05），維生素C 組、藍莓花青素組較油酸誘導組降低（P＜0.05），藍莓花青素組較維生素C 組降低（P＜0.05）。見圖3、4 和表2。

表2 各組AML12細胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白相對表達量比較 （±s）

表2 各組AML12細胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白相對表達量比較 （±s）

組別對照組油酸誘導組維生素C組藍莓花青素組F 值P 值Plin5 0.85±0.08 1.41±0.34 1.03±0.08 0.68±0.03 9.240 0.006 PI3K 0.75±0.10 1.27±0.20 0.87±0.04 0.58±0.07 18.431 0.001 P-Akt 0.45±0.13 0.63±0.03 0.38±0.07 0.32±0.10 7.067 0.012

圖3 各組AML12細胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白相對表達量比較 （±s）

圖4 各組AML12細胞Plin5、PI3K和P-Akt蛋白的表達

3 討論

肝臟作為調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)平衡的主要器官之一，其脂肪酸主要有兩種代謝方式：一是線粒體β 氧化；二是游離脂肪酸與甘油進行酯化形成TG，儲存在脂滴[10]。當肝細胞攝入脂肪酸過量時，β 氧化途徑受到抑制，脂質(zhì)沉積加劇，導致脂肪變性[11]。本實驗采用較高濃度油酸誘導AML12 細胞后，細胞培養(yǎng)上清液中肝功能損傷指標ALT 和AST 水平、細胞內(nèi)TG 含量、脂滴數(shù)量均顯著高于對照組；上述結(jié)果提示油酸誘導肝細胞發(fā)生明顯脂肪變性及損傷，模型復制成功。根據(jù)文獻報道，黃酮類化合物可以提高細胞抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，并減少脂質(zhì)沉積[12]。藍莓富含多種抗氧化活性物質(zhì)如黃酮類、多酚類化合物，其中抗氧化主要活性物質(zhì)——花青素，屬黃酮類化合物，是一種水溶性天然色素[8]，本實驗采用具有抗氧化活性的水溶性維生素C 作為陽性對照，經(jīng)維生素C 及藍莓花青素處理后，維生素C 組、藍莓花青素組細胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST 水平以及細胞內(nèi)TG 含量、脂滴數(shù)量較油酸誘導組均降低。提示藍莓花青素可有效降低肝細胞內(nèi)脂滴沉積并改善肝細胞損傷，且與維生素C 作用相似。

在肝細胞內(nèi)脂質(zhì)以脂滴的形式沉積，而脂滴周圍覆蓋有多種脂滴蛋白，其中Perilipin 家族蛋白是研究比較廣泛的一類脂滴蛋白[13]。目前，Plin1、Plin4 主要表達于脂肪組織中，Plin2、Plin3 可見于許多細胞類型。而Plin5 多表達于脂肪酸氧化代謝旺盛的組織，如心臟、肝臟、骨骼肌等。Plin5 作為新發(fā)現(xiàn)的成員，其亞細胞定位主要在脂滴表面[14]。Plin5 能夠通過抑制TG 脂解和/或降低脂肪酸氧化，促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累[15]。本實驗油酸誘導組Plin5 蛋白表達較對照組顯著增加，其表達和脂滴增加一致。LI 等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)油酸刺激后AML12 小鼠肝細胞中Plin5 的表達呈濃度及時間依賴性升高，與其相似，提示油酸誘導Plin5 蛋白表達促進脂質(zhì)沉積。維生素C、藍莓花青素干預后，Plin5 蛋白表達水平相較于油酸誘導組均明顯下降，提示維生素C、藍莓花青素能夠抑制油酸誘導的Plin5 蛋白表達，起到減少脂質(zhì)沉積的作用。同時，研究發(fā)現(xiàn)Plin5 蛋白可通過PI3K/Akt 途徑促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[6]。ZHONG 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PI3K 可以降低油酸誘導的HepG2 細胞中Plin5 的表達及脂滴沉積。以上研究均提示，脂滴蛋白與PI3K/Akt 信號通路的調(diào)控密切相關(guān)。

基于“脂質(zhì)代謝異常加劇肝臟脂肪沉積，進一步發(fā)生氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化，最終導致NAFLD 的發(fā)生”這一共識，PI3K/Akt 信號通路將有望成為改善NAFLD 的靶點[18]。近年來，關(guān)于PI3K/Akt 在脂質(zhì)代謝方面的研究不斷增多，越來越多的學者認為PI3K/Akt 信號通路能促進脂質(zhì)合成并抑制脂肪分解，是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要通路[19]。此外，研究發(fā)現(xiàn)藍莓花青素能夠影響PI3K/Akt 信號通路蛋白的表達[20]。本研究中油酸誘導組PI3K、P-Akt 蛋白表達相較于對照組顯著增加，而維生素C 組、藍莓花青素組Plin5、PI3K、P-Akt 蛋白表達較油酸誘導組降低，藍莓花青素組及維生素C 組下調(diào)結(jié)果一致。由此推測，藍莓花青素可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路影響Plin5 蛋白的表達，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂滴的沉積，但PI3K/Akt 信號通路是直接調(diào)控還是間接調(diào)控Plin5 蛋白的表達仍需進一步研究。

綜上所述，藍莓花青素在一定程度上可以改善油酸誘導的小鼠肝細胞脂肪變性。在油酸誘導小鼠肝細胞發(fā)生脂肪變性時，藍莓花青素可能通過抑制Plin5 蛋白的表達減少肝脂肪變性。筆者推測其機制是通過藍莓花青素抑制PI3K/Akt 信號通路使Plin5 蛋白表達下降，減弱Plin5 蛋白促進細胞內(nèi)脂質(zhì)積累的功能，達到改善油酸誘導的小鼠肝細胞脂肪變性的目的。但是其詳細作用機制，仍需進一步深入研究。