薛欣欣，王文斌，羅雪華，張永發(fā)，趙春梅

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，土壤肥料研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101

引 言

天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有非常重要的地位和作用。橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)是天然橡膠的重要來(lái)源，為我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物。然而，我國(guó)橡膠林的大規(guī)模墾植、刺激割膠應(yīng)用、化肥施用不當(dāng)?shù)仍斐赡z園土壤肥力出現(xiàn)下降趨勢(shì)[1-2]。研究表明，海南植膠后土壤速效鉀含量?jī)H為未開(kāi)墾土壤的50%[3]。橡膠缺鉀會(huì)造成碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)受阻、葉片結(jié)構(gòu)(面積、厚度、葉綠體結(jié)構(gòu)等)發(fā)生變化[4]，進(jìn)而影響橡膠樹(shù)產(chǎn)、排膠及橡膠質(zhì)量[5]。海南作為我國(guó)最大的熱區(qū)之一，其磚紅壤具有陽(yáng)離子交換能力低、強(qiáng)風(fēng)化、酸性和砂質(zhì)等特點(diǎn)，土壤中水合半徑較大的鎂離子存在較高的淋失風(fēng)險(xiǎn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，海南植膠區(qū)80%以上的土壤交換性鎂含量低于正常值[7]。橡膠缺鎂會(huì)造成暴光老葉葉脈間呈魚(yú)骨褪綠而變黃，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)黃葉落葉病，影響產(chǎn)量形成[8]。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)技術(shù)是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，可對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析，具有靈敏度高，制樣方法簡(jiǎn)單，樣品用量少，測(cè)試時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[9]。植物體內(nèi)生物大分子如核酸、脂類和碳水化合物，具有特征性的官能團(tuán)和獨(dú)特的分子振動(dòng)模式，通過(guò)分析紅外光譜吸收位置、寬度和強(qiáng)度，有助于了解植物體內(nèi)有機(jī)物分子官能團(tuán)的組成和結(jié)構(gòu)特征。以往研究認(rèn)為，植株組織的FTIR吸收峰特征會(huì)因營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的不同而產(chǎn)生差異[10-11]。Butler等[12]證實(shí)FTIR能夠?qū)θ扁}脅迫下模式植物鴨跖草的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行精確評(píng)估。王盛峰等[13]利用FTIR研究了缺鋅條件下玉米碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)及核酸等組分發(fā)生了改變。有報(bào)道利用FTIR研究了低硼和高硼脅迫下影響柑橘葉片物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)。有工作對(duì)棉花功能葉片F(xiàn)TIR譜圖特征峰的研究發(fā)現(xiàn)缺鉀破壞了葉片表皮結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)、纖維素、可溶性糖和核糖等結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，缺硼造成蛋白質(zhì)及可溶性糖、纖維素等碳水化合物在葉片大量積累。姚宇潔等[14]利用FTIR研究了枳橙實(shí)生苗缺鐵脅迫下葉片蛋白質(zhì)、纖維素、可溶性糖和核糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化而且含量降低。盡管如此，利用FTIR技術(shù)對(duì)橡膠葉片物質(zhì)成分構(gòu)成及其對(duì)鉀、鎂脅迫的響應(yīng)鮮有報(bào)道。本研究以橡膠樹(shù)幼苗作為試驗(yàn)材料，采用FTIR技術(shù)來(lái)表征鉀鎂脅迫下橡膠葉片化學(xué)組分的變化特征，以期為橡膠鉀、鎂生理代謝的機(jī)制研究提供新的思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)計(jì)

1.2 取樣與測(cè)定

葉片樣品采集和處理：橡膠幼苗培養(yǎng)60 d后，選取橡膠幼苗頂端完全展開(kāi)葉片，一級(jí)水沖洗干凈后將樣品置于105 ℃烘箱中殺青30 min，之后在75℃烘箱中烘干至恒重，磨細(xì)并過(guò)100目篩，備用。

樣品測(cè)定：采用溴化鉀壓片法。壓片之前，將溴化鉀(光譜純)粉末放入烘箱烘干至恒重，然后分別稱取葉片粉末樣品和溴化鉀(光譜純)0.200和2.000 g(質(zhì)量比1∶10)加到瑪瑙研缽中，在紅外燈照射干燥條件下按同一方向磨細(xì)呈淀粉狀，取少許樣品，在真空條件下，用壓桿緩慢加壓至約15 MPa，維持1 min左右，得到樣品薄片；采用上述方法，將溴化鉀制成薄片作為背景。將薄片放在Nicolet公司的Inpact-410型FTIR光譜儀上進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，掃描累加次數(shù)32，分辨率4 cm-1，每個(gè)樣品測(cè)定前均對(duì)背景進(jìn)行掃描，去除背景的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用OMNIC8.2軟件對(duì)葉片樣品的FTIR譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 鉀鎂脅迫下橡膠葉片的FTIR全圖譜分析

橡膠幼苗葉片的紅外光譜圖如圖1所示。各化學(xué)鍵的吸收處于中紅外區(qū)，即波數(shù)為4 000～400 cm-1。各處理下的葉片具有一些典型的共有吸收峰，但各處理間的特征峰數(shù)目以及相對(duì)吸光度存在不同程度差異。結(jié)合表1進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與正常處理(CK)相比，缺鉀(-K)條件下，橡膠葉片1 554，1 519和1 075 cm-1處的吸收峰缺失，并且3 345和1 541 cm-1處的吸收峰分別向高頻方向位移了9和6 cm-1后分別位于3 354和1 547 cm-1處；缺鎂(-Mg)條件下，橡膠葉片1 075 cm-1處的吸收峰缺失，并且3 345，1 631，1 554和1 057 cm-1處的吸收峰分別向高頻方向位移了8，4，6和11 cm-1；鉀鎂同時(shí)缺乏(-K-Mg)條件下，1 554，1 519和1 075 cm-1處吸收峰缺失，并且3 345和1 541 cm-1處的吸收峰向高頻方向位移了8和5 cm-1。由此可見(jiàn)，鉀、鎂營(yíng)養(yǎng)缺乏下，橡膠葉片物質(zhì)組分結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

表1 不同處理下橡膠葉片的特征峰Table 1 Characteristic peak of FTIR in rubber leaf under different treatment

圖1 不同處理下橡膠葉片的FTIR全譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.1 FTIR spectra of the leaves of rubber seedlings under different treatments (4 000～400 cm-1)

4 000～400 cm-1范圍，鉀鎂同時(shí)缺乏條件下特征峰的相對(duì)吸光度明顯低于其他處理，且特征峰吸收強(qiáng)度明顯減弱；缺鉀條件下的特征峰相對(duì)吸光度高于正常處理；在4 000～1 600 cm-1波數(shù)范圍，缺鎂條件下的特征峰相對(duì)吸光度高于正常處理，而波數(shù)處于1 600～400 cm-1時(shí)，缺鎂則低于正常處理。由此表明，鉀、鎂營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，橡膠葉片各物質(zhì)組分的含量發(fā)生了改變。由于1 800～900 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)特征峰的數(shù)量較為集中，且相對(duì)吸光度變化幅度最顯著，為提高譜圖的分辨率以減少疊加，對(duì)不同處理下1 800～900 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的FTIR譜圖做進(jìn)一步分析。

2.2 缺鉀脅迫下橡膠葉片1 800～900 cm-1FTIR圖譜分析

由圖2可知，與正常處理(CK)相比，缺鉀(-K)條件下橡膠葉片在1 800～900 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰數(shù)量、吸光度以及吸光強(qiáng)度等方面均發(fā)生了明顯的變化，其中，1 554和1 075 cm-1處的特征峰缺失，結(jié)合紅外光譜特征峰歸屬表(表2)可知，1 554 cm-1附近表征總蛋白酰胺Ⅱ帶吸收，為C—N鍵和N—H鍵的彎曲振動(dòng)，1 075 cm-1附近表征碳水化合物C—O鍵的伸縮振動(dòng)，由此可見(jiàn)，低鉀脅迫破壞了蛋白質(zhì)及碳水化合物的分子結(jié)構(gòu)，這與郝艷淑在棉花上的研究結(jié)果相似[15]。此外，相比正常處理下的1 541.01 cm-1的吸收峰，缺鉀脅迫造成該吸收峰向高頻方向移動(dòng)6.40 cm-1，1 541 cm-1為蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶，說(shuō)明缺鉀脅迫影響了橡膠葉片中C—N鍵和N—H鍵的結(jié)合，造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

表2 葉片官能團(tuán)和相應(yīng)的紅外吸收頻率Table 2 Functional groups of the leaf and the corresponding infrared absorption frequencies

由圖2可明顯看到，缺鉀脅迫時(shí)各特征峰的相對(duì)吸光度均高于正常處理，說(shuō)明缺鉀脅迫影響葉片蛋白質(zhì)及可溶性糖、纖維素、果膠、酯類等碳水化合物的積累，并造成光合產(chǎn)物向韌皮部的運(yùn)輸或轉(zhuǎn)載受阻，導(dǎo)致這些大分子物質(zhì)較多的積累在葉片中，進(jìn)而影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。該結(jié)果與相關(guān)研究相似，但與有些研究結(jié)果相反。研究認(rèn)為，缺鉀條件下棉花功能葉片蛋白質(zhì)和碳水化合物纖的含量均降低。分析以上結(jié)果差異的可能原因，一方面與缺鉀造成光合作用減弱，蛋白質(zhì)和碳水化合物合成受阻有關(guān)[16]，另一方面也可能與品種的鉀效率高低有關(guān)(鉀高效品種降低、低效品種積累)[15]。以往研究通過(guò)化學(xué)分析方法也證實(shí)了本研究結(jié)果，即缺鉀橡膠葉片中可溶性糖含量顯著增加、葉綠體中的淀粉粒明顯增多，導(dǎo)致碳水化合物在葉片中積累，阻礙了其向其他器官的運(yùn)輸[4]。

圖2 缺鉀條件下橡膠葉片的FTIR光譜特征(1 800～900 cm-1)Fig.2 FTIR spectra of the leaves of rubber seedlings under K deficiency (1 800～900 cm-1)

2.3 缺鎂脅迫下橡膠葉片1 800～900 cm-1FTIR圖譜分析

圖3 缺鎂條件下橡膠葉片的FTIR光譜特征 (1 800～900 cm-1)Fig.3 FTIR spectra of the leaves of rubber seedlings under Mg deficiency (1 800～900 cm-1)

2.4 鉀鎂同時(shí)缺乏橡膠葉片1 800～900 cm-1FTIR圖譜分析

分析圖4，與正常處理(CK)相比，鉀鎂同時(shí)缺乏(-K-Mg)條件下橡膠葉片F(xiàn)TIR圖譜的吸收峰明顯變少，并且吸收峰的吸光強(qiáng)度明顯減弱，由此說(shuō)明鉀鎂同時(shí)缺乏造成橡膠葉片中蛋白質(zhì)、脂類、纖維素、可溶性糖等含量明顯下降以及某些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，1 554，1 519和1 075 cm-1吸收峰缺失，這與缺鉀脅迫較為相似，其中1 554 cm-1吸收峰附近為蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶的C—N伸縮振動(dòng)，1 519 cm-1為酚類物質(zhì)的苯環(huán)骨架振動(dòng)，1 075 cm-1為碳水化合物的C—O伸縮振動(dòng)，說(shuō)明鉀鎂同時(shí)缺乏破壞了蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶、酚類物質(zhì)以及碳水化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。另外，鉀鎂同時(shí)缺乏造成1 541.01 cm-1向1 546.19 cm-1位移了5.18 cm-1，1 541 cm-1附近的吸收峰為蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶的N—H彎曲振動(dòng)，進(jìn)一步也說(shuō)明鉀鎂同時(shí)缺乏造成蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖4 鉀鎂同時(shí)缺乏條件下橡膠葉片的FTIR光譜特征 (1 800～900 cm-1)Fig.4 FTIR spectra of the leaves of rubber seedlings under both K and Mg deficiency (1 800～900 cm-1)

3 結(jié) 論

采用傅里葉紅外光譜測(cè)定了不同鉀、鎂脅迫處理下的橡膠葉片化學(xué)物質(zhì)組成。得到以下結(jié)論：(1)缺鉀造成橡膠葉片中蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶、酚類物質(zhì)、碳水化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)受到破壞，以及蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)在葉片中大量積累；(2)缺鎂降低了細(xì)胞壁多糖以及含油脂化合物的含量，1 550～1 350 cm-1波段內(nèi)的吸收峰可以較好地指示橡膠葉片鎂營(yíng)養(yǎng)狀況；(3)鉀鎂同時(shí)虧缺造成橡膠葉片中果膠類多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)、脂類、糖類物質(zhì)等物質(zhì)含量均明顯下降。本研究表明，使用FTIR技術(shù)對(duì)養(yǎng)分缺乏下的橡膠葉片物質(zhì)成分定性分析具有一定的可行性，同時(shí)可為橡膠鉀、鎂營(yíng)養(yǎng)生理代謝的機(jī)制研究提供新的思路和方法。