崔棟， 肖娜， 鐘冠南， 楊曉華， 顧嘉穎， 洪文騰

深圳市鹽田區(qū)疾病預防控制中心，廣東 深圳 518000

腸道病毒和感染性腹瀉病毒由于傳播途徑復雜，傳染性強，控制難度大，易引起學校和托幼機構聚集性疫情，造成嚴重的公共衛(wèi)生危害。腸道病毒主要包括脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《尽⑿履c道病毒等在內的多個血清型，可致腸道與呼吸道感染、脊髓灰質炎、心肌炎、無菌性腦膜炎和手足口病等多種感染。2010年以來手足口病發(fā)病率一直處于我國法定傳染病首位[1]。我國感染性腹瀉的疾病負擔主要集中在5歲以下兒童，其中輪狀病毒性腸炎是我國5歲以下兒童感染性腹瀉的主要疾病負擔[2]。傷殘調整壽命年(disability adjusted life years，DALYs)是反映疾病對人群壽命損失影響的綜合指標，在 22 種食源性病原體中，諾如病毒DALYs 排名首位[3]。本研究對深圳市鹽田區(qū)人群腸道病毒及常見感染性腹瀉病毒感染情況進行分析，了解和評估其腸道病毒及常見感染性腹瀉病毒隱性感染狀況，為制定防控措施、評估疫情趨勢及疫苗接種等提供科學依據。

1 對象與方法

1.1調查對象 2020年6月選取鹽田區(qū)海山、沙頭角、鹽田、梅沙四個街道，采整群抽樣方法在每個街道隨機抽取1個社區(qū)，每個社區(qū)抽取居民200人，覆蓋兒童、青年、中年、老年各年齡組人群，收集糞便樣品。

1.2檢測方法 取1～2 g糞便加入1 mL 生理鹽水，震蕩混勻，8 000×g離心5 min，取上清提取總核酸。采用實時熒光定量PCR方法檢測糞便中諾如病毒、札如病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腸道腺病毒、腸道病毒通用型、腸道病毒71型(enterovirus 71,EV 71)、柯薩奇病毒A16型(Coxsackie virus 16,CV-A16)。核酸提取使用西安天隆核酸自動提取儀，核酸提取試劑使用重慶中元匯吉生物有限公司核酸提取試劑盒(磁珠法)，具體操作方法參考試劑盒說明書。檢測試劑購自深圳市奧東生物科技有限公司。

1.3基因組測序 選取RT-PCR陽性樣本，提取病毒核酸后送上海伯杰生物科技有限公司進行病毒基因組全長測序。

1.4序列分析 通過Nucleotide Blast 功能對比 NCBI 數據庫中與其最接近的已知基因序列進行檢索，并獲得相應型別的代表毒株序列。利用DNAstar中Seqman軟件對測序結果進行拼接整理，整理好的序列由諾如病毒基因分型網站(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/)進行基因分型、病毒序列比對和構建進化樹。采用MEGA軟件對病毒核苷酸進行序列比對和系統發(fā)育樹構建。使用鄰近(Neighbor-Joining)繪制進化樹，Bootstrap Replications數值設置為1 000。

2 結 果

2.1基本情況 調查實際收集并檢測糞便樣品共813份，札如病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腸道腺病毒、EV 71和CV-A16未檢出；腸道病毒通用型檢出2例，陽性率為0.25%；諾如病毒檢出4例，均為諾如GⅡ型，陽性率為0.49%。諾如陽性樣本編號分別為20SZYT0162、20SZYT0165、20SZYT0166、20SZYT1046。

2.2基因分型結果 選取核酸陽性標本進行序列測定，腸道病毒通用型均為幼童口服脊髓灰質炎疫苗所致；4份諾如病毒陽性樣本成功測序2份，上傳在線基因分型網站比對后顯示20SZYT0166為GⅡ.2-GⅡ.P16型，20SZYT1046樣本為GⅡ.17-GII.P17型。

2.3諾如病毒系統進化分析 20SZYT0166聚合酶區(qū)基因序列與2020年廣州1174株(MT856644)處于同一分支且序列親緣性關系最近，核苷酸同源性為 99.47%(圖 1)。20SZYT0166衣殼區(qū)基因序列與2016 年北京BISCY株(KY421123)，2016年廣東16SF2026 株(KY485116)、016T03株/T01株(KY457586/KY457584)，2017年浙江DingHai05株(MH057762)，2018年深圳2018046株(MK614132)以及2020年日本1047F株(LC646333)序列核苷酸同源性為100%(圖 2)。

圖1 諾如病毒GⅡ.2-GⅡ.P16型(20SZYT0166)聚合酶區(qū)系統進化分析

圖2 諾如病毒GⅡ.2-GⅡ.P16型(20SZYT0166)衣殼區(qū)系統進化分析

20SZYT1046聚合酶區(qū)與2014 年上海1427004株(KT380915)以及2016年廣東本土16F0784GDMM株(MH569708)、16F0791GDMM株(MH569706)、16F0791GDSZ株(MH569705)、16F0792GDSZ株(MH569704)、17F3414GDDG株(MH569702)的序列親緣性關系最近，核苷酸同源性為100%(圖3)。20SZYT1046衣殼區(qū)基因序列進化樹分析表明，20SZYT1046毒株序列與2015 年浙江湖州N15002株(KY344348)、2015 年北京1514株(KT633395)以及2016年日本AichiF4株(LC349993)序列有較近的親緣性關系，核苷酸同源性為 97.0%～97.3%(圖4)。

圖3 諾如病毒GⅡ.17-GⅡ.P17型(20SZYT1046)聚合酶區(qū)系統進化分析

圖4 諾如病毒GⅡ.17-GⅡ.P17型(20SZYT1046)衣殼區(qū)系統進化分析

3 討 論

腸道病毒隱性感染在人群中普遍存在，難以鑒別和發(fā)現，為疾病預防和控制帶來困難[4]。采用Meta方法分析我國健康人群人類腸道病毒隱性感染情況，發(fā)現我國健康人群腸道病隱性感染率為18.8%，其中EV71隱性感染率為3.7%，CV-A16隱性感染率為1.9%，其他腸道病毒隱性感染率為15.1%[5]。采用酶聯免疫分析方法檢測西安市某醫(yī)院221名健康體檢人群外周血 EV 71-IgM，隱性感染率為8.14%[6]。研究發(fā)現兒童?？漆t(yī)院醫(yī)務人員手足口病EV71和CV-A16隱性感染比例高，存在著一定程度EV71和CV-A16隱性感染情況[7]。本研究在健康人群中未能檢測出腸道病毒，可能是由于采樣時間為腸道病毒非流行期，且檢測方法為單一核酸檢測。

對北京市餐飲服務單位人員諾如病毒隱性感染情況調查發(fā)現，餐飲服務單位工作人員諾如病毒隱性感染率為0.29%[8]。浦東新區(qū)重點機構從業(yè)人員諾如病毒感染調查顯示，共調查從事保育員、保潔員、營養(yǎng)員等工種的無癥狀從業(yè)人員589名，經核酸檢測確認諾如病毒隱性感染8名，隱性感染率為1.36%[9]。本研究中鹽田區(qū)健康人群諾如病毒隱性感染率為0.49%，與北京市餐飲單位人員結果接近，低于上海浦東新區(qū)。廣東省諾如病毒感染暴發(fā)疫情基因型結果分析顯示，GⅡ.2型主要涉及小學、幼托機構和中學，以接觸傳播為主；GⅡ.17型主要涉及中學和其他社會單位，以食源性傳播為主，GⅡ.2和GⅡ.17型主要感染未成年人群，其中GⅡ.2型感染的人群年齡較GⅡ.17型更低[10]。2014年冬季，出現了一種新型的諾如病毒變異株GⅡ.17_Kawasaki_2014，在日本和中國等亞洲國家引起了一系列急性胃腸炎暴發(fā)[11]，隨后我國多個城市相繼暴發(fā)[12]。研究發(fā)現GⅡ.17-GⅡ.P17能和多種類型的人組織血型結合抗原(HGBAs)結合使得其侵襲力增強[13]。2016年底發(fā)現了一種以前較少出現的重組諾如病毒 GⅡ.2-GⅡ.P16，并成為我國諾如病毒暴發(fā)疫情的主要病原體[14]。我國2016年10月至2018年9月全國556起諾如暴發(fā)疫情調查發(fā)現，81.2%的諾如病毒暴發(fā)類型為GⅡ.2-GⅡ.P16[15]。研究發(fā)現GⅡ.2-GⅡ.P16株具有更強的復制能力，更有可能發(fā)生大流行[16]。 GⅡ.17-GⅡ.P17型和GⅡ.2-GⅡ.P16型諾如病毒在全球范圍內具有持續(xù)和廣泛的流行能力，且本次監(jiān)測到的毒株與省內諾如疫情毒株序列高度同源，應進一步加強轄區(qū)諾如病毒的監(jiān)測。

針對腸道病毒和感染性腹瀉病毒的流行特點，相關部門應該采取措施加快相關疫苗接種工作，尤其是學校和托幼結構接種工作；制定嚴格的傳染病管控措施，加強對重點人群、重點場所監(jiān)測；此外應重視食品衛(wèi)生和飲食習慣，開展健康教育，改善環(huán)境衛(wèi)生，提升居民健康素養(yǎng)，倡導健康生活方式，有效降低腸道病毒和感染性腹瀉病毒感染風險。