李丹（天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院,天津 301800）

子宮內(nèi)膜癌屬于臨床上較為常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，且隨著人們生活方式的不斷改變以及生活壓力的與日俱增，該病的發(fā)病率正呈逐年攀升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康的重大疾病之一[1-2]。該病多見于絕經(jīng)后女性，其中3/4的患者均在50歲以后發(fā)病，年輕患者的占比為2%-14%，近年來有年輕化趨勢(shì)[3]。由于該病發(fā)病早期具有極強(qiáng)的隱匿性，絕大部分患者一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術(shù)根治的最佳時(shí)期，化療是目前臨床上用以治療中晚期子宮內(nèi)膜癌患者的關(guān)鍵方法[4]。其中鉑類與紫杉醇類聯(lián)合是臨床上首選的化療方案，但其普遍存在化療不敏感以及誘導(dǎo)耐藥情況，晚期患者經(jīng)治療后5年總生存率在25%左右[5]。因此，如何有效解決患者化療耐受的方法顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點(diǎn)。有研究表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)密切相關(guān)，多種生長(zhǎng)因子及其相關(guān)肽類、子宮內(nèi)膜各類細(xì)胞和卵巢分泌激素之間形成了互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)子宮內(nèi)膜周期性改變起到復(fù)雜而有序的調(diào)控[6]。白血病抑制因子（LIF）屬于白細(xì)胞介素-6（IL-6）家族重要成員之一，具有較為廣泛的生物學(xué)活性，已被證實(shí)和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。鑒于此，本文通過研究病理檢測(cè)過表達(dá)LIF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞耐受化療藥物的作用，以期為該病患者的治療方案制定提供科學(xué)依據(jù)，繼而改善患者預(yù)后?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 ①儀器：Synergy2多功能酶標(biāo)儀；Mini Protean電泳、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)膜設(shè)備以及CFX9熒光定量PCR系統(tǒng)（BIO-RAD）；多功能成像系統(tǒng)（UVITEC）；Gallios流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）。②試劑：胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素（P/S）以及DMEM/F12培養(yǎng)液均購(gòu)自ThermoFisher；胰島素（Merck）；順鉑及紫杉醇（阿拉?。籆CK-8試劑盒（同仁）；Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒（凱基）；JC-1檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒以及RIPA裂解液（碧云天）；Bcl-2、Bcl-XL、Bax抗體（Cell Signal）。

1.2 研究方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2實(shí)施規(guī)范培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增處理，最后保存在醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室液氮罐內(nèi)。完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、5mg/L胰島素以及1%P/S的DMEM/F12培養(yǎng)液。其中細(xì)胞換液、傳代、凍存以及復(fù)蘇具體操作均遵循常規(guī)規(guī)范完成，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2，37.5℃恒溫。②細(xì)胞模型構(gòu)建：轉(zhuǎn)染前夜進(jìn)行消化傳代293FT細(xì)胞處理，并將其接種在明膠包被的培養(yǎng)介質(zhì)中，放置在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)過夜。之后根據(jù)15∶8∶12比例充分混合pLVX-IRES-Puro、PMD2.G以及psPAX2，具體操作以說明書為準(zhǔn)。采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染混合物，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)6h。除去培養(yǎng)液，采用PBS重復(fù)沖洗3次，并加入完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染過夜之后采集培養(yǎng)液上清，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾之后，直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞、正常培養(yǎng)。定時(shí)6-10h更換1次含病毒的培養(yǎng)液，持續(xù)3d。感染結(jié)束之后，更換完全培養(yǎng)液實(shí)施1d培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)并長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，傳代、凍存。針對(duì)傳代過夜細(xì)胞，予以0.1-10mg/L的含Puro篩選培養(yǎng)液。③CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性：以96孔板為介質(zhì)，以5000個(gè)細(xì)胞/孔的標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞接種至孔板內(nèi)，并放置在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)6h。培養(yǎng)完成之后，每孔內(nèi)加入1/10培養(yǎng)液體積的CCK-8溶液，孵育60min后以酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后完成上述操作，測(cè)定各孔450nm處的吸光度，并計(jì)算相對(duì)吸光度。④Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：采用Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒完成，相關(guān)操作以試劑盒說明書為準(zhǔn)，借助流式細(xì)胞分析儀實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)。⑤JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位情況：相關(guān)操作以試劑盒說明書為準(zhǔn)，即根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，采集細(xì)胞孵育JC-1染液，采用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)，調(diào)整并采集所有樣品前散射光、側(cè)散射光、綠光以及紅光通道信號(hào)，以前散射光/側(cè)散射光做散點(diǎn)圖標(biāo)記主細(xì)胞群，隨后以綠光/紅光對(duì)上述主細(xì)胞群作圖分成綠光以及紅光陽性的高線粒體膜電位細(xì)胞。⑥免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平：采用BCA蛋白定量試劑盒完成，相關(guān)操作以試劑盒說明書為準(zhǔn)，以多功能成像儀自動(dòng)成像觀察蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理工具選擇SPSS22.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，開展正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的表示方式為[n(%)]，開展χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞體外活性的影響 兩組細(xì)胞24h、48h、72h相對(duì)吸光度對(duì)比均不明顯（均P＞0.05）。見表1。

表1 兩組細(xì)胞體外活性的影響（±s）

表1 兩組細(xì)胞體外活性的影響（±s）

組別 例數(shù) 24h相對(duì)吸光度 48h相對(duì)吸光度 72h相對(duì)吸光度過表達(dá)組 3 2.31±0.32 4.71±0.41 9.01±0.42對(duì)照組 3 2.25±0.31 4.34±0.32 8.82±0.36 t-0.310 1.232 0.595 P-0.772 0.285 0.584

2.2 兩組化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞能力對(duì)比 過表達(dá)組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在順鉑及紫杉醇作用下的細(xì)胞凋亡率分別低于對(duì)照組（均P＜0.05）。見表2。

表2 兩組化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞能力對(duì)比（±s,%）

表2 兩組化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞能力對(duì)比（±s,%）

組別 例數(shù) 順鉑 紫杉醇過表達(dá)組 3 27.58±2.69 31.26±2.78對(duì)照組 3 68.73±11.27 74.92±12.06 t-6.151 6.110 P-0.004 0.004

2.3 兩組化療藥物破壞腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的作用效果對(duì)比過表達(dá)組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在順鉑及紫杉醇作用下的細(xì)胞線粒體膜電位分別高于對(duì)照組（均P＜0.05）。見表3。

表3 兩組化療藥物破壞腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的作用效果對(duì)比（±s,%）

表3 兩組化療藥物破壞腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的作用效果對(duì)比（±s,%）

組別 例數(shù) 順鉑 紫杉醇過表達(dá)組 3 42.38±6.29 31.89±4.56對(duì)照組 3 17.26±3.12 12.74±2.15 t-6.197 6.579 P-0.003 0.003

2.4 兩組Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平對(duì)比 過表達(dá)組Bcl-2及Bcl-XL蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于對(duì)照組，而Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（均P＜0.05）。見表4。

表4 兩組Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平對(duì)比（±s）

表4 兩組Bcl-2家族蛋白表達(dá)水平對(duì)比（±s）

組別 例數(shù) Bcl-2 Bcl-XL Bax過表達(dá)組 3 2.71±0.31 1.74±0.12 -1.24±0.08對(duì)照組 3 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 t-15.141 25.115 26.847 P-0.000 0.000 0.000

3 討論

有研究表明，功能性LIF屬于分泌型糖蛋白之一，人類LIF基因主要定位于第22號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)為6.0kb，含有3個(gè)外顯子以及2個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)內(nèi)堿基存在較高的保守性[8-10]。LIF作為一種具備多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，國(guó)內(nèi)對(duì)其相關(guān)研究主要集中于生殖醫(yī)學(xué)方面。LIF在生殖周期中和子宮功能以及調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)密切相關(guān)，且子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞是LIF表達(dá)的重要部位，LIF表達(dá)在一定程度上受月經(jīng)周期變化影響，分泌期表達(dá)最高，可能和其在一定程度上受卵巢激素調(diào)節(jié)有關(guān)[11-13]。隨著近年來相關(guān)研究的日益深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)LIF存在多個(gè)可變剪切體，在功能方面存在一定的差異，而在實(shí)體瘤中，LIF主要扮演著功能性細(xì)胞因子的角色，促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展以及放化療抵抗[14-15]。

本文結(jié)果還顯示了過表達(dá)組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在順鉑及紫杉醇作用下的細(xì)胞凋亡率均低于對(duì)照組。這提示了過表達(dá)LIF會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性，增強(qiáng)其對(duì)順鉑及紫杉醇的抵抗作用。究其原因，LIF可通過LIF受體增強(qiáng)STAT3的磷酸化水平和轉(zhuǎn)錄水平，繼而對(duì)和疾病進(jìn)展以及化療抵抗相關(guān)的基因表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用，進(jìn)一步增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性。這在國(guó)外學(xué)者YU[16]等人的研究報(bào)道中得以佐證：借助逆轉(zhuǎn)錄病毒建立穩(wěn)定過表達(dá)LIF的結(jié)直腸癌細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞大量分泌LIF，并對(duì)STAT3信號(hào)通路起到激活作用，促使P53蛋白表達(dá)水平下降，最終減弱化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的滅殺作用。此外，雖然順鉑及紫杉醇治療子宮內(nèi)膜癌的機(jī)制存在根本差異，但其均可對(duì)線粒體功能產(chǎn)生破壞，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，然而過表達(dá)LIF可有效穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細(xì)胞凋亡。究其原因，可能和過表達(dá)LIF可激活STAT3信號(hào)通路，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白水平有關(guān)。由此可見，LIF可能介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展以及化療抵抗，可能是該病的治療靶點(diǎn)。此外，Bcl-2及Bcl-XL均是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的抗凋亡蛋白，而Bax屬于促凋亡蛋白。而本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組Bcl-2及Bcl-XL蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，而Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組。這充分說明了LIF影響子宮內(nèi)膜癌耐受化療藥物的可能機(jī)制之一和調(diào)控上述細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，過表達(dá)LIF會(huì)在一定程度上增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性，增強(qiáng)其對(duì)順鉑及紫杉醇的抵抗作用，其主要作用機(jī)制可能和上調(diào)Bcl-2及Bcl-XL表達(dá)以及下調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)。