陳徵婷，可小麗，陳剛，黃麗芳，劉志剛，盧邁新

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510380； 2.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025； 3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院，廣東 廣州 510550)

無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae隸屬于鏈球菌屬Streptococcus，依據(jù)Lancefield氏血清分類法將其歸為B族，故無乳鏈球菌也稱B族鏈球菌，簡稱GBS，該菌是導(dǎo)致人畜共患病的重要細(xì)菌性病原之一[1-2]。1966年，Robinson等[3]在淡水魚金色美鳊Notemigonuscrysoleucas中首次分離到GBS。此后，多種海水和淡水魚類均出現(xiàn)感染GBS的報道，如鯡Brevoortiapatronus、條紋胭脂魚Mugilcephalus、大西洋黃魚Micropogoniasundulatus、銀鱒Cynoscionnothus等海水魚[4-5]，易感淡水魚包括胭脂魚Lizaklunzingeri、斑馬魚Daniorerio、金頭鯛Sparusauratus、銀鯧Pampusargenteus、石斑魚Epinepheluslanceolatus、寶石鱸Scortumbarcoo、虹鱒Oncorhynchusmykiss等[6-8]，淡水羅非魚Oreochromisniloticus是近10年來受無乳鏈球菌感染最嚴(yán)重的宿主[9-12]。目前，有效防治仍然是鏈球菌病研究的重點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，雖然抗生素是一種比較快捷實用的方法，但其存在嚴(yán)重的耐藥風(fēng)險[13-14]，而疫苗作為免疫防治的重要手段之一，具有高效、特異、無污染等優(yōu)點(diǎn)，是水產(chǎn)病害防控的良好選擇。

目前，魚類無乳鏈球菌疫苗大部分仍處于研發(fā)階段，如滅活疫苗[15]、減毒疫苗[12,16]及各類基因工程疫苗等[17-19]，其中，基因工程疫苗的關(guān)鍵是獲得優(yōu)質(zhì)的候選抗原。無乳鏈球菌莢膜多糖在毒力方面起著重要作用，且具強(qiáng)有效的抗原性，因此，基于其莢膜多糖相關(guān)疫苗一直是研究熱點(diǎn)，然而，莢膜多糖基因具有多態(tài)性，導(dǎo)致其跨血清型交叉免疫保護(hù)一直未能獲得理想的效果。研究表明，GBS表面蛋白抗原作為疫苗候選抗原或特異性GBS多糖的載體蛋白[20]，具有大多數(shù)GBS血清型中保守的抗原靶點(diǎn)，是跨血清保護(hù)性疫苗的良好候選者，LrrG蛋白便是其中之一。

LrrG是無乳鏈球菌表面蛋白之一，LrrG基因編碼一種新的富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)基序，與細(xì)菌侵襲素共同存在。重組蛋白LrrG具有GBS黏附素的功能，在小鼠體內(nèi)具有較高的免疫原性，可誘導(dǎo)特異性IgG，相對免疫保護(hù)率達(dá)91%[21]，且其編碼的新型富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)在各無乳鏈球菌血清型中(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅷ)均十分保守[22]。本研究團(tuán)隊前期曾利用原核表達(dá)的LrrG重組蛋白作為疫苗抗原對羅非魚無乳鏈球菌病進(jìn)行免疫保護(hù)試驗，口服或注射免疫條件下均顯示具有良好的免疫原性，相對免疫保護(hù)率達(dá)69%～77%[23]，不足是LrrG可溶性上清重組蛋白的表達(dá)量有限。

密碼子優(yōu)化是通過在信使RNA編碼區(qū)進(jìn)行密碼子同義突變以增加蛋白表達(dá)產(chǎn)量的重要方法，目前在生物制藥領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[24]?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，本研究中嘗試通過密碼子優(yōu)化獲得LrrG重組蛋白的可溶性上清蛋白，同時對優(yōu)化后的重組蛋白進(jìn)行免疫原性驗證，以期為無乳鏈球菌LrrG表面蛋白基因工程疫苗的制備提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自Tiangen公司；pCzn1質(zhì)粒、BL21(Plys)表達(dá)菌株由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司提供；限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA 聚合酶購自TaKaRa公司；Protein Marker購自Thermo公司；T4 DNA連接酶購自 Promega公司；IPTG、Acr、Bis、Tris購自Sigma 公司；SDS購自Amresco公司；TEMED購自BIO-RAD公司；Tyrptone、Yeast Extract購自O(shè)xoid公司；0.22 μm無菌過濾器、透析袋購自Millipore公司；DNA膠純化試劑盒購自Axygen公司；SDS-PAGE凝膠配制、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Binding buffer、Elution buffer購自生工生物工程(上海)股份有限公司；His Bind親和純化試劑盒購自BIO Basic公司；PVDF膜購自Pall公司；鼠抗His單克隆抗體購自Abmart公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自Millipore公司；TMB 顯色液購自Biopanda公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

儀器：Mini Protean Ⅱ垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(均為美國BIO-RAD 公司)；PTC-200基因擴(kuò)增儀(美國MJ Research公司)；320-S pH 計(美國 Mettler Toledo公司)；AR5120電子天平(美國Aohaus公司)；MultiTemp III恒溫水浴鍋、Hofer UV-25紫外透射儀(美國Amersham Pharmacia 公司)；雪花狀制冰機(jī)(日本Sanyo公司)；JY92-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(中國新芝科器研究所)；NANODROP2000(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1LrrG基因優(yōu)化與合成 根據(jù)本實驗室分離并保存的羅非魚源無乳鏈球菌(Ⅰa，ST7)的LrrG基因序列(登錄號: KC920814.1)，利用密碼子優(yōu)化軟件(南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司)對LrrG基因進(jìn)行優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的前提下，利用宿主細(xì)胞對密碼子的偏好性，將低頻稀有密碼子替換為使用頻率較高的密碼子，同時對編碼疏水區(qū)和信號肽區(qū)的基因序列進(jìn)行分析，并在優(yōu)化后基因引物的兩端分別加入NdeⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)和 His 標(biāo)簽序列。根據(jù)優(yōu)化后的基因序列，采用PAS (PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因，設(shè)計全長拼接引物，引物為Primer-F: ACGCCATATCGCCGAAAGG；Primer-R: GGCAGGGATCTTAGATTCTG。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2 pCzn1-LrrG重組表達(dá)載體的構(gòu)建 利用雙酶切法，將LrrG基因插入到表達(dá)載體pCzn1的NdeⅠ和XbaⅠ間。首先將pCzn1載體用NdeⅠ和XbaⅠ酶進(jìn)行雙酶切，然后再與LrrG基因連接，酶切體系為：pCzn1載體5.0 μL，10×FD buffer 5.0 μL，NdeⅠ (10 U/μL)2.5 μL，XbaⅠ(10 U/μL)2.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL，37 ℃下酶切1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收，將回收的酶切產(chǎn)物和目的DNA片段用連接酶在37 ℃下連接25 min。連接體系為：LrrGDNA 4.0 μL，線性載體pCzn1 3.5 μL，T4連接酶(5 U/μL)2.5 μL。

1.2.3 pCzn1-LrrG重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定

將連接產(chǎn)物pCzn1-LrrG轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，向感受態(tài)細(xì)胞中加入連接液10 μL，于冰上放置30 min。將樣品管迅速置于42 ℃水浴中熱激90 s，之后迅速置于冰上冷卻5 min，再向管中加入800 μL LB液體培養(yǎng)基。于37 ℃下以220 r/min振蕩培養(yǎng)50 min后，涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上37 ℃下靜置1 h，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37 ℃下靜置培養(yǎng)16～20 h。次日觀察菌落，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系為：質(zhì)粒3 μL，NdeⅠ和XbaⅠ酶各0.25 μL，10×buffer 1.0 μL，ddH2O 6.5 μL。經(jīng)菌液PCR和雙酶切后，進(jìn)行測序(廣州艾基生物有限公司)。

1.2.4 表達(dá)菌株的制備 將質(zhì)粒1 μL加入100 μL大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(Plys)感受態(tài)細(xì)胞中，置于冰上20 min，42 ℃下熱激90 s，迅速置于冰中5 min，加入600 μL LB培養(yǎng)液，37 ℃下以200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后，涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板上，37 ℃下倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落接種到含有50 μg/mL氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)3 h，取0.5 mL菌液與0.5 mL 50%的無菌甘油混合，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取轉(zhuǎn)化好的表達(dá)菌株單克隆，接種于含50 μg/mL AMP的4 mL LB培養(yǎng)液試管中，于37 ℃下以220 r/min振搖過夜，次日按1∶100接種于含50 μg/mL AMP的200 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃下以220 r/min振搖至菌體OD600 nm值為0.6，取出1 mL培養(yǎng)物，以10 000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μL Binding buffer緩沖液重懸菌體沉淀，向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃下以220 r/min振搖6 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，取出1 mL培養(yǎng)物，室溫下以10 000g離心2 min，棄上清，用100 μL Binding buffer重懸菌體沉淀。剩余培養(yǎng)物以4 000g離心10 min，棄上清，用Binding buffer重懸菌體沉淀，重懸液用冰浴超聲波破碎60 min，超聲時間5 s，間隔10 s，功率300 W，然后分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% 的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色檢測。

1.2.6 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的純化及與優(yōu)化前LrrG重組蛋白表達(dá)量的比較 優(yōu)化前LrrG重組蛋白利用PET-32a-LrrG重組表達(dá)菌株，依照陳雪[23]所述表達(dá)條件進(jìn)行，并確保其誘導(dǎo)表達(dá)前的OD值與優(yōu)化后LrrG重組蛋白pCzn1-LrrG的OD值保持一致。利用NI-IDA純化樹脂預(yù)裝柱子進(jìn)行純化，采用重力法使存儲緩沖液完全流出。加入2倍柱體積的Binding buffer 到預(yù)裝柱中進(jìn)行平衡，控制流速約為1 mL/min。將蛋白和Binding buffer混勻，使其總體積相當(dāng)于兩個柱體積。將混合液加入柱子，收集流穿液到離心管中。用兩倍柱體積的Binding buffer清洗柱子并收集流穿液。用兩倍柱體積的Elution Buffer洗脫柱上的蛋白，此步驟重復(fù)兩次。將洗脫的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，并采用ImageJ軟件分析優(yōu)化前后LrrG重組蛋白上清表達(dá)量的相對差異。

1.2.7 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的Western blot鑒定

SDS-PAGE電泳完畢后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，轉(zhuǎn)印后PVDF膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉室溫封閉30 min，分別采用兩套抗體進(jìn)行Western blot鑒定：用一抗鼠抗His-tag(兔抗GBS多克隆抗體)(1∶5 000)和二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠(HRP標(biāo)記的羊抗兔)(1∶5 000)，先后與轉(zhuǎn)印后的PVDF膜反應(yīng)，用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影，觀察結(jié)果。

1.2.8 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的免疫原性 選取同等大小規(guī)格的健康吉福羅非魚(體質(zhì)量為3.4 g±0.8 g，體長為4.2 cm±0.2 cm)，試驗前已暫養(yǎng)2周，將試驗魚隨機(jī)分為4組(每組50尾)，LrrG重組蛋白免疫組和對照組(PBS代替蛋白)各2組，試驗組免疫劑量為2 μg/g(蛋白質(zhì)量/魚體質(zhì)量)，用PBS將優(yōu)化后的LrrG可溶重組蛋白稀釋至所需濃度，與弗氏不完全佐劑1∶1混合后，進(jìn)行腹腔注射免疫，對照組注射等體積的PBS。同時，利用相同規(guī)格的健康吉福羅非魚進(jìn)行無乳鏈球菌毒株(LZ1F-Ia-ST7)的半致死劑量LD50檢測，具體參考陳雪[23]的方法。免疫兩周后，利用LZ1F-Ia-ST7 LD50對所有免疫魚體進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)記錄死亡情況，2周后統(tǒng)計各組死亡率。

相對免疫保護(hù)率(relative percent survival，RPS)計算公式為

RPS=(1-試驗組死亡率/對照組死亡率)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚源無乳鏈球菌LrrG基因的優(yōu)化

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，LrrG基因序列中存在6個原核表達(dá)體系中使用頻率低于20%的稀有密碼子，決定對其進(jìn)行替換優(yōu)化。其次，蛋白N端第763AA～775AA為較強(qiáng)的疏水區(qū)，經(jīng)預(yù)測N端759AA～778AA為典型的跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽結(jié)構(gòu)，因此，決定去掉N端第763 AA之后的序列進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)。原始LrrG基因序列全長為2 361 bp，優(yōu)化后的基因加入了酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽等，去掉了無信號肽的疏水區(qū)基因序列。經(jīng)測序，優(yōu)化后的完整LrrG基因序列全長為2 286 bp，G+C含量有明顯變化，優(yōu)化前后分別為34.94%和45.67%，符合G+C含量在30%～70%為理想?yún)^(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)。氨基酸序列完全一致，優(yōu)化前后基因序列比對結(jié)果如圖1所示。利用軟件對密碼子優(yōu)化后的LrrG基因預(yù)測的LrrG蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，分子結(jié)構(gòu)式為C3862H6182N1084O1162S12。預(yù)測的蛋白理論相對分子質(zhì)量為86 777，理論等電點(diǎn)pI值為9.17，不穩(wěn)定性指數(shù)為30.53，因大于閾值40時性質(zhì)不穩(wěn)定，說明優(yōu)化后的蛋白性質(zhì)較為穩(wěn)定。

Origina為原始LrrG基因序列；Optimized為優(yōu)化后的LrrG基因序列；下劃線為優(yōu)化后基因與原始基因的差異堿基位點(diǎn)；實線方框內(nèi)為起始密碼子；虛線方框內(nèi)為終止密碼子。Origina represents the original sequence of the LrrG gene; Optimized represents the optimized sequence of the LrrG gene; The differential nucleotide sites between the original and optimized sequence of the LrrG gene are shown by underlines; Initiation codon is shown in the solid box and the stop codon is shown in the dotted box.圖1 LrrG 基因優(yōu)化前后核苷酸序列對比Fig.1 Alignment of nucleotide sequences between the original LrrG gene and the optimized LrrG gene

2.2 重組質(zhì)粒pCzn1-LrrG的構(gòu)建與鑒定

將優(yōu)化的目的基因片段和線性化的pCzn1載體進(jìn)行連接(圖2)，連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建無乳鏈球菌表面蛋白LrrG的重組表達(dá)載體pCzn1-LrrG。將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒電泳后呈現(xiàn)環(huán)狀、線性和超螺旋3種基本形態(tài)，酶切后的pCzn1線性載體和LrrG基因片段大小與理論值(4 400 bp和2 286 bp)相符，且酶切條帶單一，表明重組載體構(gòu)建成功(圖3)。利用引物(pCzn1-F: ACGCCATATCGCCGAAAGG；pCzn1-R: GGCAGGGATCTTAGATTCTG)進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果顯示，插入片段堿基序列與優(yōu)化后的LrrG基因堿基序列一致，其編碼的氨基酸序列與優(yōu)化前編碼的氨基酸序列完全一致，表明LrrG優(yōu)化基因插入片段完全正確，未發(fā)生堿基突變。

圖2 pCzn1載體構(gòu)建圖譜Fig.2 pCzn1 vector construction map

1—酶切前質(zhì)粒；2—酶切后質(zhì)粒；M—DL4500 DNA marker。1—plasmid before restriction digestion; 2—plasmid after restriction digestion; M—DL4500 DNA marker.圖3 重組質(zhì)粒pCzn1-LrrG的酶切Fig.3 Restriction digestion of recombinant plasmid pCzn1-LrrG

2.3 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

測序驗證正確的pCzn1-LrrG表達(dá)菌株單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，以未加入IPTG作為對照。經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳分析，目標(biāo)蛋白主要存在于上清中，這說明，37 ℃誘導(dǎo)條件下LrrG蛋白在原核表達(dá)宿主BL21(Plys)中已成功誘導(dǎo)表達(dá)，該蛋白相對分子質(zhì)量為108 000(圖4)。

M—蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—未誘導(dǎo)總蛋白；2—誘導(dǎo)總蛋白；3—誘導(dǎo)上清；4—誘導(dǎo)包涵體。M—protein marker; 1—uninduced total protein; 2—induced total protein; 3—induced supernatant; 4—induced inclusion bodies.圖4 優(yōu)化后His-LrrG重組蛋白的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of codon optimized His-LrrG recombinant protein

2.4 LrrG重組蛋白的純化及其優(yōu)化前后蛋白表達(dá)量的比較

誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液經(jīng)超聲波破碎后，對上清液進(jìn)行Ni-IDA 柱親和層析純化，隨后利用SDS-PAGE對純化的蛋白進(jìn)行檢測。SDS-PAGE分析結(jié)果(圖5)顯示，菌體沉淀溶解后的上清液在相對分子質(zhì)量為108 000附近出現(xiàn)高濃度的目的條帶，且條帶單一。不同批次誘導(dǎo)表達(dá)后，上清穩(wěn)定表達(dá)，且優(yōu)化后LrrG重組蛋白的表達(dá)量為1.5～1.8 mg/mL，優(yōu)化前LrrG重組蛋白的表達(dá)量為0.43～0.74 mg/mL(圖5、圖6)。用ImageJ軟件分析累積光密度顯示，優(yōu)化后的表達(dá)量相對優(yōu)化前提高了2.2～3.8倍。

M—蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1—未誘導(dǎo); 2—流過液; 3—洗脫后的可溶蛋白。M—protein marker; 1—uninduced; 2—liquid flowed through column; 3—eluted soluble protein.圖5 優(yōu)化后His-LrrG重組蛋白純化的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of codon optimized His-LrrG fusion protein purification

M—蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—未誘導(dǎo)重組菌全菌蛋白；2—重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)物；3—誘導(dǎo)上清；4—洗脫后的可溶蛋白。M—protein marker; 1—the uninduced recombinant total bacterial protein; 2—the induced recombinant total bacterial protein; 3—the induced supernatant; 4—eluted soluble protein.圖6 優(yōu)化前His-LrrG重組蛋白純化的SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of His-LrrG fusion protein purification

2.5 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的Western blot鑒定

在Western blot試驗中，重組蛋白LrrG與一抗為鼠抗His-tag單克隆抗體和兔抗GBS多克隆抗體均可以發(fā)生反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約108 000附近均有特異雜交條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致，表明優(yōu)化后的重組蛋白LrrG具有GBS抗原反應(yīng)原性(圖7)。

1—一抗為鼠抗His-tag單克隆抗體；2—一抗為兔抗GBS多克隆抗體。1—primary antibody is mouse anti His-tag monoclonal antibody; 2—primary antibody is rabbit anti GBS polyclonal antibody.圖7 重組蛋白LrrG的Western blot鑒定Fig.7 Western blot identification of recombinant protein LrrG

2.6 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的免疫原性

用優(yōu)化后的可溶蛋白LrrG免疫羅非魚2周后，利用無乳鏈球菌毒株LZ1F-Ia-ST7半致死劑量1.19×106CFU/mL進(jìn)行人工攻毒LrrG免疫組和對照組羅非魚。結(jié)果顯示：蛋白免疫組死亡率為16%～20%，平均死亡率為18%，相對免疫保護(hù)率為61.54%～69.23%，平均相對免疫保護(hù)率為65.39%；PBS對照組死亡率為50%～54%，平均死亡率為52%(表1)。

3 討論

3.1 羅非魚源無乳鏈球菌重組LrrG蛋白的優(yōu)化表達(dá)

羅非魚鏈球菌病傳染性強(qiáng)、死亡率高，給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[25-26]。其主要病原無乳鏈球菌，根據(jù)其莢膜多糖(CPS)基因座序列的不同，可分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ等10個血清型[27]，雖然目前Ⅰa(92.3%)和Ⅰb(7.7%)是羅非魚無乳鏈球菌病的兩種主要血清型[28]，但后期菌株變異的風(fēng)險也不可忽視。

目前，基于無乳鏈球菌保守表面蛋白的新疫苗候選蛋白已開展大量研究，包括LrrG、ScpB、Lmb、表面免疫原性蛋白Sip，以及含有C蛋白α和β成分的肋骨和串聯(lián)重復(fù)序列等[29]。其中，LrrG蛋白編碼一種新的LPXTG錨定的表面抗原，該表面抗原含有細(xì)菌入侵素和LRR蛋白家族等成員中發(fā)現(xiàn)的富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)受體[30]。重組LrrG蛋白在體外顯示出以依賴的方式黏附于上皮細(xì)胞，表明它可能在GBS中起黏附因子的作用，且在小鼠和羅非魚中均表現(xiàn)出較好的相對免疫保護(hù)率[22-23]。為進(jìn)一步提高重組LrrG蛋白在大腸桿菌原核表達(dá)的上清表達(dá)量，本研究中對其進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。大腸桿菌是體外重組蛋白生產(chǎn)的優(yōu)選宿主，因為其生長快，易于操作，培養(yǎng)成本低，且遺傳學(xué)研究充分。但是在異源蛋白表達(dá)過程中，因異源基因可能只包含少數(shù)可在表達(dá)宿主中使用的密碼子，原始的編碼序列在新的宿主中通常會阻止或限制重組蛋白的表達(dá)，因此，重組蛋白通常較難在其原始環(huán)境之外表達(dá)[31]。大腸桿菌也不例外，利用大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，在大腸桿菌中稀有密碼子的存在通常會對蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，容易造成重組蛋白的異源表達(dá)量低下[32]。一般情況下，在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性蛋白比總蛋白表達(dá)困難得多，通常需要優(yōu)化宿主菌株和培養(yǎng)條件，以及篩選最佳的基因片段和融合標(biāo)簽[33-35]。所以，可以通過密碼子優(yōu)化的策略來解決異源表達(dá)基因的問題，進(jìn)而提高蛋白表達(dá)量[36]。本研究中，通過替換LrrG蛋白中大腸桿菌稀有密碼子，并進(jìn)一步優(yōu)化其疏水區(qū)和無信號肽區(qū)域等，重新構(gòu)建了高表達(dá)載體pCzn1-LrrG，獲得了大腸桿菌BL21(Plys)重組表達(dá)菌株。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的重組菌株LrrG上清表達(dá)量明顯高于優(yōu)化前，表明按照大腸桿菌密碼子進(jìn)行優(yōu)化可以提高外源原核生物基因編碼的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量，這與其他研究者的結(jié)論相符。何明娟等[37]通過密碼子優(yōu)化的辦法在大腸桿菌中高效表達(dá)了馬檳榔甜蛋白。李文鋒等[38]通過密碼子優(yōu)化提高了新型鴨呼腸孤病毒σB蛋白原核表達(dá)量。高見等[39]優(yōu)化了高危型人乳頭瘤病毒L2E7基因密碼子，Wang等[40]優(yōu)化了人類膀抑素C基因密碼子，均使目標(biāo)蛋白的原核表達(dá)量得到了不同程度的提高。其中，潘群興等[41]優(yōu)化雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因密碼子，結(jié)果顯示，密碼子優(yōu)化型重組菌表達(dá)量能提升至野生型重組融合蛋白GST-VP2表達(dá)量的2倍。本研究中，通過比較優(yōu)化前后的LrrG重組蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后LrrG重組蛋白的上清表達(dá)量較優(yōu)化前提高了2.2～3.8倍。

3.2 優(yōu)化后LrrG重組蛋白的免疫原性

優(yōu)化后的蛋白抗原是否保持其原有的免疫原性，是決定其是否可用于后續(xù)應(yīng)用的關(guān)鍵。本研究中，首先通過Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的LrrG重組蛋白不僅可以和鼠抗His-tag發(fā)生特異性結(jié)合，也可以和兔抗GBS多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說明密碼子優(yōu)化后的LrrG重組蛋白具有GBS抗原反應(yīng)原性。進(jìn)一步通過LrrG注射免疫羅非魚，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的LrrG重組蛋白對羅非魚抗GBS感染具有61.54%～69.23%的相對免疫保護(hù)率，平均約為65.39%，這與優(yōu)化前的相對免疫保護(hù)性結(jié)果相似[23]，說明優(yōu)化后的LrrG重組蛋白仍然具有較好的免疫原性。該結(jié)果為無乳鏈球菌表面蛋白疫苗的研發(fā)及應(yīng)用提供了科學(xué)參考。

4 結(jié)論

1) 重組表達(dá)載體pCzn1可用于優(yōu)化后LrrG重組蛋白的表達(dá)。

2) 通過密碼子優(yōu)化可提高無乳鏈球菌表面蛋白LrrG在大腸桿菌中的表達(dá)量。

3) 優(yōu)化后的LrrG重組蛋白仍然具有較好的免疫原性。