胡玲紅，王映，王化敏，陳良標(biāo),3*

(1.海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2.水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

魚(yú)類是一種水生變溫脊椎動(dòng)物，水溫變化與魚(yú)類的生存息息相關(guān)，魚(yú)類生存的環(huán)境溫度是影響魚(yú)類代謝、發(fā)育、生長(zhǎng)等生理活動(dòng)最重要的非生物因素[1]。魚(yú)類有其適宜的生存溫度范圍，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)破壞魚(yú)類機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，并使魚(yú)類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)以重新建立穩(wěn)態(tài)，但持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)會(huì)使機(jī)體的防御系統(tǒng)遭到破壞，最終導(dǎo)致魚(yú)類死亡[2-3]。

鰓是魚(yú)類的主要呼吸器官，具有氣體交換、離子平衡、調(diào)節(jié)滲透壓等功能。有研究表明，魚(yú)鰓在魚(yú)類響應(yīng)環(huán)境的變化時(shí)具有重要意義[4]。Sollid等[4]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲鯽Carassiusauratus在冷應(yīng)激和缺氧條件下鰓的形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，認(rèn)為主要是由細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)造成的[5]。Hu等[6]對(duì)斑馬魚(yú)Daniorerio和尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus在8 ℃下低溫脅迫12 h的鰓組織凋亡情況研究發(fā)現(xiàn),在所檢測(cè)的8個(gè)器官中鰓的凋亡最為明顯，這提示鰓是魚(yú)類感知外界變化最敏感的器官。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自我消亡過(guò)程，對(duì)于機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)和正常生理功能具有重要意義[7]。研究表明，熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體中過(guò)氧化物含量升高，使細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量升高，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷[8]。斑馬魚(yú)卵巢在熱應(yīng)激下能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡[9]。銀漢魚(yú)Odontesthesbonariensis雄性生殖細(xì)胞在熱應(yīng)激下凋亡細(xì)胞增加，半光氨酸蛋白酶(caspase)活性達(dá)到峰值，最終導(dǎo)致不育[10]。低溫脅迫可能導(dǎo)致ROS增加，當(dāng)ROS含量超出生物體應(yīng)對(duì)這些物質(zhì)的能力時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激[11]。低溫脅迫下,尼羅羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)鰓組織發(fā)生凋亡[12]，斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides和暗紋東方鲀Takifuguobscurus肝臟凋亡途徑被激活并誘導(dǎo)caspase家族、B淋巴細(xì)胞瘤2基因(bcl2)、bax等凋亡基因表達(dá)發(fā)生變化[13-14]。

青鳉Oryziaslatipes是一種常見(jiàn)的模式生物魚(yú)類[15]，具有體型較小、性別差異明顯、時(shí)代周期短、胚胎時(shí)期對(duì)環(huán)境比較敏感等特性。目前，對(duì)于青鳉的研究主要集中在環(huán)境毒理、發(fā)育生長(zhǎng)，以及溫度對(duì)其攝食和生理變化等方面[16-20]。趙艷民等[17]研究發(fā)現(xiàn)，水中銅含量過(guò)高對(duì)日本青鳉肝臟組織造成了明顯損傷。林晶等[20]研究發(fā)現(xiàn)，河流汞污染會(huì)嚴(yán)重影響青鳉的早期生長(zhǎng)發(fā)育。王潤(rùn)萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高于31 ℃或低于15 ℃的溫度脅迫對(duì)青鳉攝食行為和生理變化會(huì)產(chǎn)生極大影響。而青鳉在溫度脅迫響應(yīng)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)Hu等[6]曾發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)在極限溫度8 ℃脅迫12 h時(shí)鰓發(fā)生了明顯的凋亡，但是青鳉在極限溫度脅迫時(shí)鰓是否發(fā)生凋亡還未知。本研究中，為探究溫度對(duì)鰓凋亡的影響，首先對(duì)青鳉的溫度耐受性進(jìn)行了測(cè)定，在低溫和高溫分別選擇兩個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行脅迫，并通過(guò)TUNEL(原位末端標(biāo)記法)染色法觀察不同溫度脅迫時(shí)青鳉鰓組織凋亡情況，再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同溫度脅迫下鰓細(xì)胞的ROS含量和凋亡率，同時(shí)檢測(cè)了青鳉鰓的凋亡相關(guān)基因(caspase家族基因、p53、bcl2)在不同溫度脅迫下的表達(dá)變化，以期為魚(yú)類響應(yīng)溫度脅迫研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)采用日本青鳉HdrR品系，為4月齡性成熟個(gè)體，飼養(yǎng)在26 ℃循環(huán)水箱系統(tǒng)中，光暗循環(huán)時(shí)間為14 h∶10 h。試驗(yàn)中涉及的所有動(dòng)物試驗(yàn)都遵照上海海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的規(guī)定嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2 方法

1.2.1 青鳉的溫度耐受性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)3組，1個(gè)低溫組(4 ℃)、1個(gè)高溫組(40 ℃)和1個(gè)常溫(26 ℃)對(duì)照組，低溫或高溫組從常溫組26 ℃開(kāi)始，以1 ℃/h的速度進(jìn)行梯度降溫或升溫[6]，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放20尾魚(yú)，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，每2 h觀察記錄一次魚(yú)的死亡情況并計(jì)算死亡率，試驗(yàn)共進(jìn)行29 h，以試驗(yàn)魚(yú)死亡率達(dá)到50%的水溫作為臨界溫度。

1.2.2 鰓組織凋亡及基因表達(dá)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)5組，2個(gè)高溫組(35、40 ℃)、2個(gè)低溫組(10、4 ℃)和1個(gè)常溫(26 ℃)對(duì)照組，高溫組或低溫組從26 ℃開(kāi)始，以1 ℃/h的速度進(jìn)行梯度升溫或降溫[6]，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放3尾魚(yú)，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，脅迫12 h后采樣。

1.2.3 組織切片和TUNEL染色樣本的采集 從脅迫12 h的每一個(gè)溫度組各選取同時(shí)期性成熟青鳉3尾，用MS-222溶液(Thermo Fisher)麻醉后，立即解剖取其鰓組織并放入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司)中固定過(guò)夜，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明1 min，浸蠟3 h后包埋，利用Leica切片機(jī)以5 μm厚度對(duì)鰓組織進(jìn)行切片，切片在37 ℃烘片機(jī)上過(guò)夜。隨后取切片進(jìn)行TUNEL染色，具體操作參考TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)的步驟，將處理好的切片使用 Leica 激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.4 鰓細(xì)胞的獲取 從脅迫12 h的每一個(gè)溫度組各取3尾青鳉鰓組織，用PBS沖洗，將組織加至含有500 μL膠原酶(1 mg/mL)的1.5 mL離心管中，置入37 ℃培養(yǎng)箱中消化組織30 min。然后用移液槍輕輕吹打分散細(xì)胞，用40 μm孔徑的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾懸濁液。以400g離心10 min并棄上清，加10%的胎牛血清(Gibco)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，獲得鰓組織單細(xì)胞懸液。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鰓細(xì)胞凋亡 將獲得的鰓組織單細(xì)胞懸液用1 mL PBS洗滌，以800 r/min離心5 min，重復(fù)洗一次。加入100 μL 1×Binding buffer(上海索萊寶生物科技有限公司)重懸細(xì)胞，試驗(yàn)組均加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI(均為上海索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品)，對(duì)照組分別單染、雙染和空白，輕輕混勻。過(guò)程中避光，室溫放置10 min，加入500 μL 1×Binding buffer，輕輕混勻，用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)檢測(cè)分析。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鰓細(xì)胞ROS 將獲得的鰓組織單細(xì)胞懸液置于1.5 mL離心管中，用1 mL PBS洗滌，以800 r/min離心5 min，重復(fù)洗一次。用1 mL PBS重懸，之后加入1 μL DCFH-DA (碧云天生物科技有限公司)配成工作液，避光，室溫下放置30 min (隔5 min輕輕混勻一次)，以800 r/min離心5 min去除DCFH-DA 工作液，再用PBS洗滌細(xì)胞3次，最后用500 μL PBS重懸細(xì)胞，使用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 RNA提取和定量PCR試驗(yàn) 從脅迫12 h的每個(gè)溫度組各取3尾魚(yú)，立即解剖取其鰓組織，放入裝有Trizol reagent(Thermo Fisher)的2 mL管中，用組織振碎儀(美國(guó)MP Biomedicals)打碎組織，嚴(yán)格按照Trizol reagent的操作說(shuō)明提取鰓的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將各個(gè)樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載差異基因的序列，使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，用于熒光定量分析(RT-PCR)。以cDNA為模板，EF-1α為試驗(yàn)內(nèi)參，并使用Vazyme ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，采用CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)體系(共20 μL)：SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下變性10 s，60 ℃下退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸5 min。融解反應(yīng)：95 ℃下 15 s，60 ℃下 60 s(數(shù)據(jù)采集)，95 ℃下 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)以減小誤差，采用2-△△ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 青鳉的溫度耐受性生存曲線

通過(guò)逐步降溫和升溫試驗(yàn)觀察青鳉狀態(tài)和存活情況。在降溫試驗(yàn)中，當(dāng)溫度從最適溫度26 ℃降到10 ℃時(shí)，魚(yú)停留在底部，游動(dòng)緩慢，攝食減少；當(dāng)溫度逐步降到4 ℃時(shí)，魚(yú)開(kāi)始停止攝食，并聚集在一起，開(kāi)始出現(xiàn)死亡。在升溫試驗(yàn)中，當(dāng)溫度從最適溫度26 ℃升至35 ℃時(shí)，魚(yú)頻繁游動(dòng)，攝食也明顯減少；當(dāng)溫度繼續(xù)升至40 ℃時(shí)，魚(yú)反應(yīng)激烈，間歇性上下躥動(dòng)，鰓部明顯發(fā)紅，身體漸漸失去平衡，開(kāi)始出現(xiàn)死亡。以26 ℃為對(duì)照，在低溫4 ℃和高溫40 ℃脅迫下，每2 h記錄青鳉死亡數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4 ℃和40 ℃脅迫12 h時(shí)，死亡率均接近50%(圖1)，以試驗(yàn)魚(yú)達(dá)到半致死率的水溫作為臨界水溫，青鳉的耐受溫度范圍為4～40 ℃。

*表示與對(duì)照組(26 ℃)有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)，下同。* means significant difference compared with the control (26 ℃)(P<0.05); ** means very significant difference compared with the control (P<0.01)，et sequentia.圖1 青鳉的溫度耐受性生存曲線Fig.1 Survival curve of medaka tolerance to temperature

2.2 不同溫度脅迫下青鳉鰓組織凋亡情況

通過(guò)TUNEL染色法檢測(cè)鰓組織的凋亡情況。從圖2可見(jiàn):以最適溫度26 ℃的青鳉鰓組織作為對(duì)照，高溫脅迫12 h時(shí)，35 ℃組鰓組織切片上出現(xiàn)零星的綠色熒光，表現(xiàn)出少量的凋亡，40 ℃組鰓組織切片上出現(xiàn)較多綠色熒光，表現(xiàn)出大量凋亡；低溫脅迫12 h時(shí)，10 ℃組鰓組織幾乎無(wú)凋亡，4 ℃組鰓組織凋亡最為明顯。由此可知，高溫和低溫脅迫時(shí)均會(huì)使青鳉鰓組織產(chǎn)生凋亡，并分別在極限溫度40 ℃和4 ℃脅迫12 h時(shí)凋亡極其顯著。

圖2 不同溫度脅迫下青鳉鰓組織凋亡情況(TUNEL染色)Fig.2 Apoptosis of the gill of medaka exposed to different temperature stresses(TUNEL stain)

2.3 不同溫度脅迫下青鳉鰓細(xì)胞凋亡情況

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同溫度脅迫下青鳉鰓細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖3(a)～(e)所示。從圖3(f)可見(jiàn)：以最適溫度26 ℃組青鳉鰓細(xì)胞作為對(duì)照，高溫脅迫12 h時(shí)，35 ℃和40 ℃組鰓細(xì)胞凋亡均表現(xiàn)出極顯著性升高(P<0.01)，凋亡率分別為15.7%和21.78%；低溫脅迫12 h時(shí)，10 ℃組鰓細(xì)胞凋亡顯著升高(P<0.05)，凋亡率為7.06%，而4 ℃組鰓細(xì)胞凋亡極顯著升高(P<0.01)，凋亡率為24.79%。這與青鳉鰓組織TUNEL染色凋亡的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.4 不同溫度脅迫下青鳉鰓細(xì)胞ROS含量

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同溫度脅迫下青鳉鰓細(xì)胞的ROS含量。從圖4可見(jiàn)：以26 ℃組為對(duì)照，在高溫脅迫12 h時(shí)，35 ℃組青鳉鰓細(xì)胞ROS的平均熒光強(qiáng)度(MFI)顯著升高(P<0.05)，40 ℃組鰓細(xì)胞ROS的MFI極顯著升高(P<0.01)；在低溫脅迫12 h時(shí)，10 ℃組青鳉鰓細(xì)胞ROS的MFI顯著升高(P<0.05)，4 ℃組青鳉鰓細(xì)胞ROS的MFI極顯著升高(P<0.01)。這表明，高溫和低溫脅迫均會(huì)引起青鳉鰓細(xì)胞ROS含量的積累。

圖4 不同溫度脅迫下青鳉鰓細(xì)胞的ROS含量Fig.4 ROS content in medaka gill cells at different temperature stresses

2.5 不同溫度脅迫對(duì)青鳉鰓組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5.1 高溫脅迫下青鳉鰓組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況 從圖5可見(jiàn)：高溫脅迫12 h時(shí)，35、40 ℃組青鳉鰓組織的p53基因表達(dá)量均顯著高于26 ℃組(P<0.05)，caspase3和caspase9基因表達(dá)量極顯著高于26 ℃組(P<0.01)；35、40 ℃組青鳉鰓組織的caspase1基因表達(dá)量均顯著低于26 ℃組(P<0.05)，40 ℃組青鳉鰓組織的bcl2基因表達(dá)量顯著低于26 ℃組，而35 ℃組青鳉鰓組織的bcl2基因表達(dá)量較26 ℃組有下降趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這表明，高溫脅迫12 h時(shí)，青鳉鰓組織的促凋亡基因(caspase3、caspase9、p53)表達(dá)均顯著上升，而抑凋亡基因(caspase1和bcl2)表達(dá)有下降趨勢(shì)。

圖5 高溫脅迫12 h時(shí)青鳉鰓凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of apoptosis-related genes in gills under heat stress for 12 hours

2.5.2 低溫脅迫下青鳉鰓組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況 從圖6可見(jiàn)：低溫脅迫12 h時(shí)，4 ℃組青鳉鰓組織的caspase3、caspase9和p53基因表達(dá)量均極顯著高于26 ℃組(P<0.01)，而10 ℃組青鳉鰓組織的caspase3、caspase9和p53基因表達(dá)量較26 ℃組有上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；4 ℃組青鳉鰓組織的caspase1和bcl2基因表達(dá)量均極顯著高于26 ℃組(P<0.01)，而10 ℃組青鳉鰓組織bcl2基因表達(dá)量顯著低于26 ℃組，10 ℃組青鳉鰓組織的caspase1基因表達(dá)量較26 ℃組有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這表明，低溫脅迫12 h時(shí)，10 ℃組青鳉鰓組織對(duì)凋亡基因的表達(dá)影響不大，4 ℃組青鳉鰓組織的凋亡相關(guān)基因均表現(xiàn)為極顯著上升。

圖6 低溫脅迫12 h時(shí)青鳉鰓凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of apoptosis-related genes in gills under cold stress for 12 hours

3 討論

水溫對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)、攝食、生理代謝有重要影響，也是影響魚(yú)類生存的重要環(huán)境因子。鰓是魚(yú)類最重要的功能器官，主要參與機(jī)體的呼吸、滲透和氮?dú)馀判惯^(guò)程，有利于維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡[21]。本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)低溫應(yīng)激下斑馬魚(yú)和羅非魚(yú)鰓差異凋亡進(jìn)行了研究，表明鰓組織在冷耐受極限時(shí)起到重要作用[6]。前期研究表明，斑馬魚(yú)耐溫性為7～40 ℃，是探究基礎(chǔ)高溫響應(yīng)分子機(jī)制較好的試驗(yàn)對(duì)象[22]。本研究中，首先對(duì)青鳉耐受溫度進(jìn)行了測(cè)定，耐受溫度為4～40 ℃；之后對(duì)高溫和低溫脅迫下青鳉鰓的凋亡情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在低溫和高溫脅迫下均引起了青鳉鰓發(fā)生凋亡和ROS水平的升高，同時(shí)凋亡相關(guān)基因也發(fā)生一定的變化。

3.1 溫度脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡

高溫、寒冷、低氧等多種外界刺激因子均會(huì)誘導(dǎo)ROS的上調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。研究表明，寒冷誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制是鐵離子和ROS的生成[24]。低溫刺激使斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞體內(nèi)積累大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞受到氧化損傷[25]。熱應(yīng)激下ROS產(chǎn)生過(guò)多會(huì)破壞線粒體膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。本研究中使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各溫度組鰓細(xì)胞進(jìn)行ROS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論高溫還是低溫均發(fā)生了ROS的積累，且在極限溫度4 ℃和40 ℃脅迫12 h時(shí)檢測(cè)到大量的ROS，這表明,高溫和低溫脅迫均會(huì)促使細(xì)胞ROS含量的上升。通過(guò)TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)青鳉鰓凋亡檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致青鳉鰓發(fā)生凋亡，且在4 ℃和40 ℃脅迫12 h時(shí)凋亡極其顯著，凋亡率分別為24.79%和21.78%。本研究中發(fā)現(xiàn)，在溫度脅迫下青鳉鰓細(xì)胞ROS的上升趨勢(shì)與鰓細(xì)胞的凋亡程度是相對(duì)應(yīng)的關(guān)系，可以推測(cè)ROS在溫度脅迫誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮著重要作用，可能是溫度脅迫誘導(dǎo)青鳉鰓細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，從而介導(dǎo)魚(yú)鰓發(fā)生細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致魚(yú)體不耐受極限溫度而死亡。

3.2 溫度脅迫對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

caspase家族基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中占據(jù)著重要地位，直接參與早期凋亡、信號(hào)傳遞和晚期凋亡效應(yīng)[27]。bcl2是一種原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[28]。p53是一種抑癌基因，其能激活很多p53靶基因，間接參與DNA損傷的修復(fù)，以及細(xì)胞衰老、分化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控[29]。凋亡的兩種途徑——外部死亡受體途徑和內(nèi)在的線粒體途徑被廣泛認(rèn)可。其中，內(nèi)在的線粒體途徑是由線粒體中細(xì)胞色素c的釋放引發(fā)的,細(xì)胞色素c可以通過(guò)含有細(xì)胞色素c/Apaf-1/caspas9的凋亡小體來(lái)激活下游效應(yīng)子caspase9和caspase3。caspase3的激活導(dǎo)致一系列蛋白質(zhì)的裂解，如核小體質(zhì)之間的蛋白、鐵蛋白，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[30]。研究表明，冷應(yīng)激通過(guò)caspase依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。高溫脅迫阻礙Hela細(xì)胞周期，促使p53表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)bax基因表達(dá)，抑制bcl2基因表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[32]。本研究中，高溫脅迫下，青鳉鰓的caspase3、caspase9和p53基因表達(dá)隨溫度的升高顯著升高，而caspase1和bcl2基因表達(dá)則隨溫度的升高而顯著降低。這表明,高溫脅迫導(dǎo)致青鳉鰓細(xì)胞發(fā)生凋亡，也產(chǎn)生大量的ROS，其凋亡途徑可能通過(guò)內(nèi)在的線粒體途徑。低溫脅迫下，青鳉鰓的caspase1、caspase3、caspase9和p53的表達(dá)在4 ℃脅迫12 h時(shí)均顯著升高，在10 ℃脅迫12 h時(shí)未明顯升高，bcl2基因的表達(dá)在低溫脅迫下呈先降低后升高的趨勢(shì)。這表明，低溫10 ℃脅迫12 h時(shí)，雖出現(xiàn)少量凋亡但凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化不大，而在臨界溫度4 ℃脅迫12 h時(shí)出現(xiàn)顯著性凋亡，且其促凋亡基因和抑凋亡基因均顯著升高，這與高溫脅迫下凋亡基因表達(dá)有所差異，可能是青鳉響應(yīng)低溫與高溫的凋亡機(jī)制有所不同，這還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

1)青鳉對(duì)溫度的耐受范圍較廣，其極限耐受溫度范圍為4～40 ℃。

2)在高溫35、40 ℃與低溫10、4 ℃脅迫12 h時(shí)，青鳉鰓細(xì)胞ROS含量與正常溫度(26 ℃)相比均出現(xiàn)顯著升高。這表明，高溫或低溫脅迫均會(huì)使青鳉鰓發(fā)生不同程度的氧化應(yīng)激。

3)溫度脅迫顯著影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致青鳉鰓細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，且在極限溫度40、4 ℃脅迫12 h時(shí)凋亡極其顯著。這表明，在極限溫度脅迫下鰓的凋亡程度影響魚(yú)的存活時(shí)長(zhǎng)，本研究結(jié)果可為今后探索魚(yú)類在極限溫度下的致死機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。