＊趙乾利 王以明

（成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院 四川 610059）

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的迅猛發(fā)展，人類社會(huì)對(duì)能源的需求量持續(xù)增長(zhǎng)，而化石燃料是用于工業(yè)生產(chǎn)的最有效資源之一，但這些化石能源開發(fā)利用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有毒氣體。能源短缺、環(huán)境污染，包括溫室效應(yīng)引起的全球變暖，最終危及人類的生命和健康。由此，對(duì)清潔可再生能源的開發(fā)利用以緩解能源短缺和環(huán)境污染問(wèn)題已變得迫在眉睫。氫能，作為一種最清潔、可持續(xù)、可再生的能源載體，是世界能源轉(zhuǎn)型的一個(gè)重大戰(zhàn)略方向，被廣泛看做未來(lái)能源系統(tǒng)中的重要媒介[1]。目前，制氫的方法主要是化學(xué)制氫，以煤炭、石油、天然氣等重整制氫為主[2]，這種制氫技術(shù)不僅能效低，而且還會(huì)加劇溫室效應(yīng)[3]。生物制氫因其高效、綠色、低成本受到了越來(lái)越多的關(guān)注和重視，并且極具發(fā)展?jié)摿?，生物制氫的研究與開發(fā)具有廣寬的應(yīng)用前景[4]。生物制氫主要有光發(fā)酵制氫和厭氧發(fā)酵制氫等，厭氧發(fā)酵制氫因其不需要光照，可連續(xù)產(chǎn)氫而優(yōu)于光合發(fā)酵制氫[5-6]，厭氧發(fā)酵制氫的菌源中對(duì)腸桿菌屬和梭狀菌屬研究得較多[7]。

大腸桿菌具有較強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力、生長(zhǎng)繁殖迅速、底物利用率高、高效且潔凈的產(chǎn)氫等特點(diǎn)[8]。大腸桿菌產(chǎn)氫被認(rèn)為是一種低能耗、無(wú)污染、可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)，在生物制氫領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

1.大腸桿菌的產(chǎn)氫機(jī)理

大腸桿菌作為兼性厭氧菌，有的可以產(chǎn)氫，有的不能產(chǎn)氫。產(chǎn)氫的大腸桿菌有4種氫酶，包括氫酶1，氫酶2，氫酶3及氫酶4[9]。氫酶1和氫酶2的作用是氧化氫氣，氫酶4一般不表達(dá)出活性，氫酶3是一種鎳鐵氫酶，主要作用就是將甲酸裂解產(chǎn)生的H+還原成氫氣[10]。鎳鐵氫酶主要由大小亞基組成，其中小亞基的作用是向鎳鐵氫酶大亞基傳遞電子[11-13]，如圖1所示。大腸桿菌的產(chǎn)氫需要借助甲酸氫酶系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)[14]。甲酸氫酶系統(tǒng)主要由甲酸脫氫酶和氫酶3組成，大腸桿菌有三種甲酸脫氫酶，即FDH-H，F(xiàn)DH-O，F(xiàn)DH-N[14]。大腸桿菌甲酸脫氫酶系統(tǒng)產(chǎn)氫包括以下三個(gè)步驟：第一步，丙酮酸在厭氧條件下被丙酮酸甲酸裂解酶催化生成甲酸；第二步，甲酸在甲酸脫氫酶FDH-H催化作用下發(fā)生反應(yīng)HCOO-→CO2+H++e-，生成H+；第三步，H+在大腸桿菌氫酶3催化下生成氫氣[14-15]。

圖1 鎳鐵氫酶產(chǎn)氫示意圖[13]

2.大腸桿菌產(chǎn)氫研究進(jìn)展

大腸桿菌是外源基因的表達(dá)宿主，具有培養(yǎng)條件和技術(shù)操作簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)大腸桿菌的代謝組學(xué)已研究得很透徹，已在生理和遺傳水平上得到最廣泛的表征[16]。與其他微生物相比較，它的代謝途徑更易改造，因此大腸桿菌被廣泛應(yīng)用于研究生物制氫。

(1)通過(guò)代謝途徑或優(yōu)化培養(yǎng)提高大腸桿菌產(chǎn)氫

我們可以使用代謝工程或基因工程的方法增加大腸桿菌氫氣產(chǎn)量[8]。Toshinari Maeda[15]通過(guò)使用代謝工程技術(shù)，整體改造大腸桿菌甲酸脫氫酶系統(tǒng)，得到最佳的代謝工程菌株BW25113 hyaB hybC hycA fdoG frdC ldhA aceE，使得大腸桿菌產(chǎn)氫量增加了兩倍，從0.65mol H2/mol葡萄糖增加到了1.3mol H2/mol葡萄糖。除了刪除某些競(jìng)爭(zhēng)途徑，也可以在大腸桿菌體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源氫酶基因來(lái)提高產(chǎn)氫。Soo Youn Lee[17]構(gòu)建了沼澤紅假單胞菌鎳鐵氫酶基因的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，通過(guò)表達(dá)來(lái)自重組大腸桿菌的HupSL氫化酶產(chǎn)生的氫氣，與對(duì)照大腸桿菌BL21(DE3)相比增加了20.9倍，比野生型紅假單細(xì)胞菌增加了218倍。Mark A.Wells[18]通過(guò)轉(zhuǎn)化藍(lán)藻鎳鐵氫酶基因，使大腸桿菌的產(chǎn)氫量明顯增加。Toshinari Maeda[19]將藍(lán)細(xì)菌的雙向加氫酶（由hoxEFUYH編碼）克隆到大腸桿菌中，使所改造的大腸桿菌產(chǎn)氫量增加了約41倍，并且表達(dá)藍(lán)細(xì)菌的鎳鐵氫酶基因的大腸桿菌產(chǎn)氫量是產(chǎn)氣腸桿菌HU-101的兩倍，他還發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌的鎳鐵氫酶基因可以抑制氫酶1和氫酶2對(duì)氫的氧化。Sanjukta Subudhi[20]從丁酸芽孢梭菌克隆到了鐵鐵氫酶基因，并將重組質(zhì)粒（pGEX-5X-hydA）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21體內(nèi)，重組大腸桿菌菌株的氫產(chǎn)率為3.2mol H2/mol葡萄糖，比野生型丁酸芽孢梭狀桿菌高出了1.68倍。此外，G.Chittibabu[21]從陰溝腸桿菌IIT-BT-08將鐵氫酶克隆到了大腸桿菌BL-21，得到的重組大腸桿菌BL-21產(chǎn)生的氫產(chǎn)量（mol H2/mol葡萄糖）為3.12mol H2/mol葡萄糖，遠(yuǎn)高于報(bào)道的陰溝腸桿菌IIT-BT-08。趙錦芳[22]克隆了陰溝腸桿菌IIT-BT 08的鐵氫酶基因片段，并將表達(dá)質(zhì)粒（pCEX-4T-2-hydA）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，得到的重組菌株產(chǎn)氫活性明顯，最大的產(chǎn)氫量為0.5mol H2/mol葡萄糖。

還可以通過(guò)數(shù)學(xué)設(shè)計(jì)和使用先進(jìn)的分離技術(shù)來(lái)間接提高氫氣的產(chǎn)量。P.Bakonyi[23]應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了使用大腸桿菌（XL1-BLUE）進(jìn)行生物制氫的關(guān)鍵因素，使其產(chǎn)氫量達(dá)到了每升培養(yǎng)基每天產(chǎn)426mL。P.Bakonyi[24]用大腸桿菌（XL1-BLUE）連續(xù)生產(chǎn)氫氣并使用聚酰亞胺膜分離純化氫氣，水力停留時(shí)間是一個(gè)重要因素，可以影響連續(xù)氫發(fā)酵的整體效率。膜分離的研究表明，聚酰亞胺膜適用于氫氣的純化，該膜能夠提高H2含量，并使CO2濃度大幅降低?；谶@些結(jié)果，精確地控制水力停留時(shí)間和底物（甲酸酯）濃度，以構(gòu)建有效的生物反應(yīng)器。我們還可以使用共培養(yǎng)來(lái)提高氫氣產(chǎn)率，Clostridium、Enterobacter和Escherichia等微生物純培養(yǎng)產(chǎn)氫量很低，B.T.Maru[26]利用大腸桿菌CECT432和產(chǎn)氣腸桿菌spH1的共培養(yǎng)（1:1）從甘油中產(chǎn)氫和乙醇，其中H2產(chǎn)量達(dá)到了12.8mM?；旌吓囵B(yǎng)發(fā)酵制氫微生物具有協(xié)同代謝作用，在提高產(chǎn)量方面效能顯著。

(2)與其他技術(shù)耦合提高產(chǎn)氫

①電刺激技術(shù)

微生物的電刺激技術(shù)是電化學(xué)與生物工程交叉領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題。近年來(lái)這一技術(shù)已在酵母發(fā)酵體系[27]、生物脫氮體系[28]、污水處理和土壤修復(fù)[29]等領(lǐng)域中得到應(yīng)用。這些研究使電場(chǎng)技術(shù)與生物工程技術(shù)之間的聯(lián)系不斷加強(qiáng)，產(chǎn)生了電化學(xué)與生物學(xué)這一交叉學(xué)科。這一交叉學(xué)科的出現(xiàn)不僅開拓了電化學(xué)技術(shù)的新領(lǐng)域，也為生物工程技術(shù)引入了新的研究方法[30]。

研究發(fā)現(xiàn)，在電刺激下，有機(jī)物和外加電源產(chǎn)氫都可以作為微生物的電子供體，對(duì)微生物的還原活性有明顯的提高。周生學(xué)[31]等人利用微直流電流研究了大腸桿菌（Escherichia coli，DH5α）生長(zhǎng)的影響，在菌液中加入適宜強(qiáng)度的電流，促進(jìn)了菌株DH5α生長(zhǎng)，細(xì)菌胞內(nèi)總蛋白含量增加，ATP酶活性增強(qiáng)，菌株的代謝水平提高。Tsong[32]等人研究發(fā)現(xiàn)ATP酶在交變電場(chǎng)中可以吸收自由能，用于補(bǔ)充生理活動(dòng)過(guò)程中生物膜離子泵所需的能量，促進(jìn)代謝水平。利用電刺激技術(shù)可以促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)代謝，增強(qiáng)細(xì)菌ATP酶活性，提高菌株的代謝水平。因此對(duì)通過(guò)代謝過(guò)程改造的大腸桿菌進(jìn)行電刺激以提高其還原力和電子供給，來(lái)進(jìn)一步提高重組大腸桿菌的產(chǎn)氫效率。

②大腸桿菌-光催化劑復(fù)合體系

通過(guò)無(wú)機(jī)納米材料和光催化所需要的酶進(jìn)行自組裝，得到微生物-光催化劑復(fù)合體系，該體系結(jié)合了生物系統(tǒng)的催化特異性，以及無(wú)機(jī)納米材料的高光電轉(zhuǎn)換效率等優(yōu)點(diǎn)[33]。并且提高了電荷傳輸和催化效率，同時(shí)減少無(wú)機(jī)材料在光催化過(guò)程中對(duì)微生物造成的光損傷，使光能在無(wú)機(jī)生物雜化系統(tǒng)的光催化制氫中得到充分利用。Wang Bo[34]等人將具有良好光催化活性的CdS無(wú)機(jī)半導(dǎo)體材料和大腸桿菌自組裝得到復(fù)合體系，該大腸桿菌-硫化鎘納米顆粒復(fù)合體系的產(chǎn)氫量明顯增加。研究表明，光催化產(chǎn)生的電子與細(xì)胞產(chǎn)氫途徑發(fā)生了相互作用。大腸桿菌產(chǎn)氫量增加的主要原因是代謝途徑的丙酮酸和甲酸鹽濃度增加，NADH/NAD比例的升高，增加了還原力。Balasubramani Ramprakash[35]將高效的光捕獲無(wú)機(jī)半導(dǎo)體（TiO2）與大腸桿菌混合形成生物催化劑用于光催化制氫，在這種雜化系統(tǒng)下，大腸桿菌的產(chǎn)氫量與光強(qiáng)有關(guān)，在2000W·m-2產(chǎn)氫量最大，與沒(méi)有TiO2的相比，產(chǎn)氫量增加了近兩倍。大腸桿菌作為典型的異養(yǎng)型細(xì)菌，本身不能利用光能進(jìn)行產(chǎn)能，然而通過(guò)微生物和無(wú)機(jī)納米材料的自組裝賦予了大腸桿菌良好的轉(zhuǎn)化光能為氫能源的能力。

3.總結(jié)與展望

本文綜述了大腸桿菌代謝途徑的改造和優(yōu)化培養(yǎng)在生物制氫方面的應(yīng)用，以及將大腸桿菌與其他技術(shù)耦合來(lái)提高其產(chǎn)氫。在所有的代謝途徑的改造策略中主要有以下兩個(gè)可以明顯的增強(qiáng)大腸桿菌的產(chǎn)氫能力：（1）刪除甲酸合成過(guò)程中的某些途徑，改造大腸桿菌的甲酸脫氫酶系統(tǒng)；（2）通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源氫酶基因。同時(shí)也可以對(duì)大腸桿菌制氫過(guò)程中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)大腸桿菌產(chǎn)氫特性和需求，得到最佳培養(yǎng)工藝。此外，將大腸桿菌與其他技術(shù)相耦合也可以提高大腸桿菌產(chǎn)氫能力，電刺激技術(shù)可以提高其代謝過(guò)程的還原力和電子供給，進(jìn)而提高產(chǎn)氫。將大腸桿菌與無(wú)機(jī)納米材料通過(guò)自組裝得到大腸桿菌-光催化劑復(fù)合體系可以使大腸桿菌具有將光能轉(zhuǎn)化為氫能的能力。目前通過(guò)代謝途徑的改造來(lái)提高大腸桿菌產(chǎn)氫是主流，如何將其他技術(shù)耦合到代謝工程中，在開發(fā)能夠高效產(chǎn)氫的工程菌株中有巨大的前景。這些工程菌株可以用于建立基于液滴的微小微生物工廠，利用液滴作為載體，在合成微空間中控制大腸桿菌細(xì)胞組織，創(chuàng)造能夠產(chǎn)氫的活性液滴。這種活性液滴可以保持厭氧環(huán)境且易于擴(kuò)大規(guī)模，為提高產(chǎn)氫提供了一種潛在的對(duì)環(huán)境友好的方法。