＊高飛 邵湘玲 李雨婷 范瀟 劉志海

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院 山東 266109）

獨(dú)一味（Lamiophlomis rotate(Benth.)Kudo）是藏藥中十分出色的一味中藥，已在少數(shù)民族中廣泛使用，該藥最早載于藏族醫(yī)藥學(xué)巨著《四部醫(yī)典》及《晶珠本草》中，且歷史悠久。書中記載該藥味甘、微苦，溫，主接骨、干黃水[1-2]。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)學(xué)研究中，該藥多用于膏藥，主要治療跌打損傷、筋骨疼痛等，其主要作用在于鎮(zhèn)痛、消炎。國內(nèi)外研究報(bào)道，獨(dú)一味具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛的藥理活性，但全部關(guān)注于獨(dú)一味中的環(huán)烯醚萜類，對其中多糖組分的生物學(xué)功能未見有報(bào)道[3]。

多糖是生命活動(dòng)中不可或缺的一部分，能夠維持和保證生物體生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)[4]。據(jù)研究表明，天然植物多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗氧化等多種藥理作用，在綠色天然產(chǎn)物領(lǐng)域是不可多得的優(yōu)秀免疫調(diào)節(jié)劑，深得國內(nèi)外學(xué)者追捧[5]。目前，提取植物多糖的方法有水提醇沉法、酸提取法、堿提取法、微波及超聲提取法等多種方法[6-8]。研究報(bào)道，使用水提醇沉法可獲得獨(dú)一味多糖，但該提取方法提取率低，而獨(dú)一味為名貴中藥，無法發(fā)揮其最大價(jià)值。酶尤其是果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶，其活性高、易得價(jià)廉，可應(yīng)用于植物多糖的提取，因此本研究使用酶解提取，并優(yōu)化其提取工藝。

1.材料與方法

(1)材料與儀器

①試劑

無水D-葡萄糖對照品（批號：110833-201205，純度：95%～98%），購自中國食品藥品檢定研究院；獨(dú)一味，購自青藏高原地區(qū)；纖維素酶（400U/g）（CAS：9012-54-8）、果膠酶（500U/g）（CAS：9032-75-1）、木瓜蛋白酶（800U/g）（CAS：9001-73-4），購自福州飛凈生物科技有限公司；80%乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純。

②儀器

循環(huán)水多用真空泵（SHZ-D(Ⅲ)型，鄭州英峪領(lǐng)科儀器設(shè)備有限公司），恒溫水浴鍋（HH-4A型，常州國華電器有限公司），超聲波清洗儀（KQ5200DA型，杭州博可超聲波設(shè)備有限公司），紫外/可見分光光度計(jì)（UV-110011型，上海天美科學(xué)儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（智拓科技控股有限公司），電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司），高速粉碎機(jī)（H5322型，邢臺中德機(jī)械制造有限公司），pH測試儀（上海佑科儀器儀表有限公司）。

(2)試驗(yàn)方法

①獨(dú)一味脫脂

將獨(dú)一味粉末用回流瓶經(jīng)80%的乙醇加熱8h，用于脫脂、脫色、除去低聚糖和小分子雜質(zhì)，置于干燥通風(fēng)處，揮干溶劑，得到干燥樣品[8]。

②糖含量測定

精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.01g，溶解于超純水，定容至100mL，得0.1mg/mL溶液。精密吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL并加超純水補(bǔ)至2mL，分別加入5%苯酚溶液1mL，搖勻，垂直液面快速加入濃硫酸5mL，搖勻。冷水浴至溫度下降到室溫，顯色。以空白為對比，將樣品置于紫外分光光度計(jì)上，測定其在490nm處的吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.0063x-0.0077（R2=0.9992），其中x為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位mg/mL，y為吸光度值[9-10]。

精密稱取獨(dú)一味多糖1mg溶解于10mL蒸餾水中，配制成0.1mg/mL溶液。吸取1mL加蒸餾水至2mL，加入5%苯酚1mL，搖勻，然后迅速垂直加入濃硫酸5mL，充分搖勻。冷水浴至溫度下降到室溫，于490nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獨(dú)一味多糖濃度，并計(jì)算多糖得率（Y）：

Y：多糖提取率（%）；C：通過對標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)曲計(jì)算得到多糖濃度（mg/mL）；V：定容體積（mL）；N：稀釋倍數(shù)；m：測定所用的多糖質(zhì)量（mg）；M：多糖質(zhì)量（g）；W：提取用獨(dú)一味粉末質(zhì)量（g）。

③單因素考察

A.溫度對獨(dú)一味多糖提取的影響

稱取3g預(yù)處理樣品，加入適量蒸餾水，浸泡2h，復(fù)合酶（果膠酶:纖維素酶:木瓜蛋白酶=2:2:1）用量2%、提取溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）、pH為6，水浴浸提90min，于100℃將酶滅活5min，棄沉淀，將上清液減壓濃縮至原體積20%，加入無水乙醇，使得乙醇終濃度為80%，置于4℃醇沉12h。棄上清液，收集沉淀真空干燥得獨(dú)一味多糖（LRP），計(jì)算多糖提取率[11]。

B.時(shí)間對獨(dú)一味多糖提取的影響

取3g預(yù)處理樣品，加入適量蒸餾水，浸泡2h，在復(fù)合酶用量2%，溫度40℃，pH為6，提取時(shí)間（30min、60min、90min、120min、150min）條件下進(jìn)行操作，同1.2.3.1，計(jì)算多糖提取率[12]。

C.pH對獨(dú)一味多糖提取的影響

稱取3g預(yù)處理樣品，加入適量蒸餾水，浸泡2h，在復(fù)合酶用量2%，溫度40℃，pH（4、5、6、7、8），提取90min條件下進(jìn)行操作，同1.2.3.1，計(jì)算多糖提取率[13]。

④響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)，利用Box-Behnken Design（BBD）中心組合方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，其中，響應(yīng)值為LRP提取率Y（%），將單因素試驗(yàn)中三個(gè)獨(dú)立變量分別進(jìn)行考察，即提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和pH（C）（每個(gè)因素取3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)對照，分別以1、0、-1對每個(gè)自變量的高、中、低實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行編碼）。實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1所示，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，并利用Design-Expert（8.0.6.1版）)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

表1 BBD響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

⑤驗(yàn)證試驗(yàn)

選取響應(yīng)面試驗(yàn)分析得出的最佳工藝參數(shù)作為提取條件，重復(fù)三次得到試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算三顆針多糖得率，以確定三顆針多糖的最優(yōu)提取工藝。

⑥紫外可見吸收光譜

配制1mg/mL的三顆針多糖溶液，以蒸餾水調(diào)零，于紫外分光光度計(jì)中200-800nm范圍內(nèi)全波長掃描。

⑦FTIR光譜

取2mg干燥的三顆針多糖粉末，與150mg溴化鉀混合研磨均勻后壓片，于紅外譜儀中400-4000cm-1范圍進(jìn)行掃描。

⑧數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸模型分析。

2.結(jié)果與分析

(1)單因素對多糖得率的影響

①提取溫度對獨(dú)一味多糖得率的影響

如圖1所示，在固定pH為6，復(fù)合酶添加量為2%，酶解時(shí)間90min條件下，酶解溫度20℃～50℃時(shí)，溫度升高與多糖得率成正效應(yīng)關(guān)系，之后進(jìn)一步提高酶解溫度則多糖得率下降。試驗(yàn)中，提取溫度由20℃提升到50℃，多糖的提取率不斷上升，然而在溫度高于50℃時(shí)，多糖提取率出現(xiàn)了顯著的下降。其原因是溫度可以提高多糖在溶劑中的溶解度、擴(kuò)散系數(shù)，使得多糖在提取時(shí)更容易沉淀，有利于多糖提??；但是，溫度過高會(huì)使得多糖降解，破壞多糖結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致提取率降低。因此，提取溫度選擇在40℃、50℃、60℃上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖1 提取溫度對獨(dú)一味多糖得率的影響

②提取時(shí)間對獨(dú)一味多糖得率的影響

如圖2所示，在固定pH為6，復(fù)合酶添加量為2%，酶解溫度40℃條件下，酶解時(shí)間30min～90min時(shí)，提取時(shí)間增加與多糖得率成正效應(yīng)關(guān)系，之后進(jìn)一步增加提取時(shí)間則多糖得率下降，因此選擇提取時(shí)間60min、90min、120min進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖2 提取時(shí)間對獨(dú)一味多糖得率的影響

③pH對獨(dú)一味多糖得率的影響

如圖3所示，在固定復(fù)合酶用量2%，提取溫度40℃，提取時(shí)間90min條件下，在pH為5～7時(shí)，多糖得率與pH值成正效應(yīng)，在pH為8時(shí)多糖得率下降，可能是過堿條件下，酶的空間結(jié)構(gòu)受到了破壞，影響了與底物的結(jié)合，從而使提取得率下降，因此應(yīng)選擇在pH為6、7、8較宜。

圖3 pH對獨(dú)一味多糖得率的影響

(2)響應(yīng)面法優(yōu)化獨(dú)一味多糖提取工藝

①模型的建立與檢驗(yàn)

以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、pH（C）為變量，獨(dú)一味多糖得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6.1軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

②回歸方程擬合及方差分析

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸模型擬合，對三個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合后得到回歸方程：Y=4.33+0.14A+0.12B+0.26C-0.29AB-0.19AC+0.82BC+1.32A2+0.32B2+0.91C2。

擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析結(jié)果見表3。校正系數(shù)R2=0.9339，R2模型的P值小于0.01，為極顯著；失擬項(xiàng)P值大于0.05，不顯著，以上說明模型擬合度較好，二次模型擬合度較高，可正確反映各因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。由模型的方差分析可得出，二次項(xiàng)A2、C2以及交互項(xiàng)BC系數(shù)的顯著性均小于0.05，其余一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)系數(shù)的顯著性均大于0.05。三個(gè)因素對響應(yīng)值的影響顯著性排序?yàn)镃＞A＞B。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

③3D響應(yīng)面和等高線圖分析

響應(yīng)面和等高線圖可直觀反映兩因素間的交互作用。響應(yīng)面圖越陡峭表明兩自變量間交互作用對響應(yīng)值影響程度越大，反之亦然。等高線圖越密集，呈現(xiàn)橢圓時(shí)表明兩變量間交互作用對響應(yīng)值影響較顯著，反之亦然。分析結(jié)果見圖4-圖6。

由圖4可知，3D響應(yīng)面圖顯示，多糖的得率受提取溫度和提取時(shí)間共同影響，且成正相關(guān)，提取溫度的升高和提取時(shí)間增加，多糖得率增加，且在提取溫度和時(shí)間達(dá)到最高值時(shí)，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢。由等高線圖可以表明，等高線沿提取溫度軸變化密集，說明提取溫度對響應(yīng)面的影響明顯顯著于提取時(shí)間。

圖4 提取溫度和提取時(shí)間對獨(dú)一味多糖得率的影響

由圖5可知，3D響應(yīng)面圖顯示，多糖的得率受提取時(shí)間和pH共同影響，且與提取時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)，與pH值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即提取時(shí)間的增加、pH的降低，多糖得率增加，且在提取時(shí)間達(dá)到最高值和pH值達(dá)到最低值時(shí)，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢。由等高線圖可以表明，等高線沿pH值軸變化密集，說明pH值對響應(yīng)面的影響明顯顯著于提取時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間和pH對獨(dú)一味多糖得率的影響

由圖6可知，3D響應(yīng)面圖顯示，多糖的得率受提取溫度和pH共同影響，且與提取溫度呈現(xiàn)正相關(guān)，與pH值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即提取溫度的增加、pH的降低，多糖得率增加，且在提取溫度達(dá)到最高值和pH值達(dá)到最低值時(shí)，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢。由等高線圖可以表明，等高線沿pH值軸變化密集，說明pH值對響應(yīng)面的影響明顯顯著于提取溫度。

圖6 提取溫度和pH對獨(dú)一味多糖得率的影響

(3)紫外吸收光譜結(jié)果分析

獨(dú)一味多糖的紫外吸收圖譜如圖7所示，獨(dú)一味多糖在280nm處有輕微吸收峰，表明該多糖中有蛋白的存在[16]；在260nm處無吸收峰，表明該多糖中無核酸的存在[17]。

圖7 獨(dú)一味多糖紫外吸收圖

(4)紅外光譜結(jié)果分析

如圖8所示，在3600cm-1～3000cm-1處，有一個(gè)吸收較強(qiáng)的寬峰，3420.16cm-1和3389.46cm-1，為-OH伸縮振動(dòng)峰；在1399.81cm-1處有振動(dòng)吸收峰，是C-H變角振動(dòng)峰[18-19]；在1168.68cm-1處的吸收峰是由吡喃糖環(huán)的醚鍵（C-O-C）和-OH伸縮振動(dòng)引起的，此4組吸收峰均是糖類物質(zhì)的特征吸收峰，說明本研究中的提取物為多糖類物質(zhì)[20-21]。另外654.66cm-1處有一強(qiáng)的吸收峰，為酰胺Ⅰ帶的吸收峰；558.26cm-1是N-H的變角振動(dòng)，為酰胺Ⅱ帶的吸收峰[22]，證明多糖中有少量的與糖結(jié)合的蛋白（如糖蛋白）存在。

圖8 獨(dú)一味多糖紅外吸收光譜

(5)驗(yàn)證試驗(yàn)

通過使用Design-Expert 8.0.6.1軟件，預(yù)測模型極值點(diǎn)，計(jì)算結(jié)果顯示最佳提取條件為：提取溫度60℃，提取時(shí)間60min，pH為6，在此最佳提取條件下預(yù)測多糖得率為7.95%。之后，按照優(yōu)化后提取條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最終測得多糖得率為（7.93±0.02）%，與預(yù)測值接近，差異不明顯，表明該模型擬合度良好[23]，因此，提取溫度60℃，提取時(shí)間60min，pH為6時(shí)提取獨(dú)一味多糖的工藝優(yōu)化合理、有效。

3.結(jié)論

通過單因素考察及RSM試驗(yàn)，確定獨(dú)一味多糖的最佳提取工藝條件為，提取溫度60℃，提取時(shí)間60min，pH為6。本研究的結(jié)果表明酶解提取獨(dú)一味多糖是一種有效、操作方便、可靠和可行的方法，其最佳提取工藝條件為提取溫度為60℃，提取時(shí)間60min，pH為6，復(fù)合酶量為2.0%。