＊孫俊樂 顧相瑞 李夢瑤 丁城灃 許志強 候冉冉

（青島農業(yè)大學化學與藥學院 山東 266109）

三顆針為小檗科植物擬豬刺（Berberis soulieana schneid.）、小黃連刺（Berberis wilsonae Hemsl.）、細葉小檗（Berberis poiretii Schneid.）或匙葉小檗（Berberis vernae Schneid.）等同屬數(shù)種植物的干燥根，又名銅刺針、刺黃柏、刺黃連等[1]，性寒味苦，有毒，歸肝、胃、大腸經。具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。主治熱痢便血、燥濕黃疸、目赤腫痛、咽喉腫痛、濕疹、瘡黃腫毒[2-4]。如三顆針15g，煎水服用，可治黃疸[5]；三顆針30g，車前子、光明草、菊花各9g，龍膽草12g水煎服，可治暴發(fā)火眼腫痛[6]；三顆針30g，山慈菇、雪膽個9g，水煎服用，可治喉痛[5]；三顆針、青黛各2份、滑石、生石膏各4份，凡士林調成25%軟膏，涂擦患處，可治濕疹、癤腫[6]。本藥主要含有小檗堿、藥根堿、受巴枯堿、掌葉防已堿等生物堿[7-12]。藥理學研究表明，三顆針具有消炎抗菌、降壓、降脂、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等生理活性[13-18]。目前國內外有關三顆針成分的研究報道主要是其生物堿部分和乙醇提取物的乙酸乙酯部分的非生物堿成分的提取分離和活性研究[19-20]，但三顆針多糖的提取及相關活性研究至今未有報道。本研究以水提醇沉方法來提取獲得三顆針多糖，考察三顆針多糖得率，在單因素試驗篩選的前提下，進行Box-Behnken設計、試驗與分析，擬合回歸方程模型，優(yōu)化篩選三顆針多糖的最佳提取工藝參數(shù)，旨在為三顆針多糖的有效提取提供依據(jù)，為三顆針多糖作為新型獸藥或飼料添加劑的研發(fā)提供材料支撐。

1.材料與方法

(1)材料

①藥材與試劑

濃硫酸、苯酚、無水乙醇均為國產分析純試劑。三顆針購于四川甘孜，經鑒定為三顆針正品。

②主要儀器

恒溫水浴鍋（HH-4A型，常州國華）；紫外/可見分光光度計（110011型，上海天美）；臺式高速冷凍離心機（Hettich UNIVERSAL 320R，德國Hettich）；電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多）；高速粉碎機（FW100型，天津泰斯特）；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS5，Thermo）。

(2)方法

①水提醇沉法提取三顆針多糖

干燥三顆針經中草藥粉碎機粉碎。稱取粉碎到適量尺寸的三顆針粉末500g置圓底燒瓶中，加入無水乙醇回流2h，過濾藥渣，干燥備用。稱取2g三顆針粉末，依據(jù)試驗設計方案中液料比、提取溫度、提取時間3個提取條件進行提取，離心（4000r/min，15min）去除雜質，收集上清液，所得提取液經4倍體積無水乙醇過夜醇沉，離心（4000r/min，15min）收集沉淀，冷凍干燥后，即得三顆針多糖。

②多糖得率測定

A.葡萄糖標曲的繪制

于100mL容量瓶中加入10mg葡萄糖標準品，加入蒸餾水溶解并定容至刻度，終濃度為100μg/mL。分別吸取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL的上述溶液置于7支10mL具塞玻璃試管中，依次加入蒸餾水使終體積為2.0mL，加入的5%苯酚溶液1.0mL后搖勻混合液，再加入濃硫酸5.0mL，搖勻后室溫放置，于490nm處檢測吸光度值。繪制葡萄糖標準曲線繪制中以濃度為x軸，吸光度為y軸。

B.三顆針多糖得率測定

精密稱取三顆針多糖1mg溶解于10mL蒸餾水中，配制成0.1mg/mL溶液。吸取1mL加蒸餾水至2mL，加入5%苯酚1mL，搖勻，然后迅速垂直加入濃硫酸5mL，充分搖勻。搖勻后室溫下放置30min，于490nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算三顆針多糖濃度。

式中，Y-三顆針多糖得率；C-三顆針多糖濃度；V-待測體積為10mL；m-三顆針多糖質量；A-測定所用三顆針多糖質量為1mg；M-三顆針樣品質量2g。

③單因素試驗

本研究中料液比（8mL/g、11mL/g、14mL/g、17mL/g、20mL/g），提取溫度（60℃、70℃、80℃、90℃和100℃），提取時間（30min、60min、90min、120min和150min）分別設置5個水平，以三顆針多糖得率為相應值，探究各因素水平對三顆針多糖得率的影響。

④Box-BehnkenDesign響應面試驗設計

依據(jù)文獻方法[21-22]，在單因素試驗篩選的前提下，使用Design-Expert（V8.0.6.1）中Box-BehnkenDesign（BBD）設計試驗方案，選取單因素試驗篩選時的液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）3個試驗因素為自變量，分別以1、0、-1編碼每個自變量在單因素試驗中篩選得到的高、中、低3個試驗水平（表1）。響應值考察三顆針多糖得率（Y），設計響應面試驗方案，通過試驗操作（3個平行操作），并用該軟件分析處理試驗結果。

表1 BBD響應面試驗因素與水平表Tab.1 Factors and levels in RSM

⑤驗證試驗

以D-E軟件中優(yōu)化得到的最佳參數(shù)作為三顆針多糖的提取試驗條件（3個重復），對比預測值以確定其最優(yōu)提取工藝條件。

(3)紫外可見吸收光譜

配制1mg/mL的三顆針多糖溶液，以蒸餾水調零，于紫外分光光度計中200-800nm范圍內全波長掃描。

(4)FTIR光譜

取2mg干燥的三顆針多糖粉末，與150mg溴化鉀混合研磨均勻后壓片，于紅外譜儀中400-4000cm-1范圍進行掃描。

(5)數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計及回歸模型分析；使用GraphPad 8.0.2進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2.結果與分析

(1)繪制標準曲線

如圖2A所示，根據(jù)試驗結果進行線性回歸分析，得到標準曲線方程y=0.0099x-0.0106，R2=0.999，在0-60μg/mL范圍內線性關系良好，可用于多糖含量測定。

圖1 三顆針Fig.1 Pharmacognostic of Barberry Root

(2)單因素試驗

①提取溫度對三顆針多糖得率的影響

固定料液比為17mL/g，提取時間為120min，研究提取溫度在60℃、70℃、80℃、90℃和100℃時對三顆針多糖得率的影響。如圖2B所示，提取溫度在60℃-100℃范圍內，隨著溫度的提高，三顆針多糖的得率隨之不斷增大。提取溫度在100℃時，三顆針多糖的得率最高。因此確定最佳提取溫度為90℃，選擇80℃、90℃和100℃這3個水平進行響應面試驗。

圖2 葡萄糖標準曲線和各因素對三顆針多糖得率的影響Fig.2 Glucose standard curve and effects of extraction factors on the yield of Barberry Root polysaccharide

②提取時間對三顆針多糖得率的影響

固定液料比為17mL/g，提取溫度為90℃，研究30min、60min、90min、120min和150min時的提取時間對三顆針多糖得率的影響。如圖2C所示，隨著提取時間延長，三顆針多糖的得率隨之增大，當提取時間為90min時，三顆針多糖的得率達到最大值，為0.44%。之后，隨著時間的增加，三顆針多糖的得率反而急劇下降。分析原因可能是當多糖提取率達到最大時，此時細胞膜內外多糖濃度達到平衡，表現(xiàn)出多糖含量并無明顯增加；當提取時間增加時，一方面是三顆針中溶解出的雜質成分也隨之增多，從而擠占了有限的溶劑空間，導致多糖浸出量下降；其次，多糖分子結構可能會隨著煎煮時間延長而發(fā)生改變，從而降低多糖的得率。因此確定最佳提取時間為90min，選擇60min、90min和120min這3個水平進行響應面試驗。

③料液比對三顆針多糖得率的影響

固定提取時間為120min不變，提取溫度為80℃，研究料液比在8mL/g、11mL/g、14mL/g、17mL/g、20mL/g時料液比對三顆針多糖得率的影響。如圖2D所示，隨著料液比的提高，三顆針多糖的得率隨之增大，當量也比為20mL/g時到達多糖得率最大值為0.28%。而料液比從17mL/g到20mL/g，多糖得率提高并不明顯。料液比增大時，細胞內外多糖濃度差梯度越大，促使細胞內多糖擴散進入溶劑，多糖得率增加。然而，當料液比超過某一限度時，使得固體藥材和溶劑間吸附作用減小，此時需增加外界做功，即若達到同等植物細胞壁破碎的效果，則需要吸收更多的外界能量，才能釋放細胞內多糖，結果變現(xiàn)出料液比過大時，導致多糖提取率增加不明顯。因此確定的最佳料液比為17mL/g，選擇料液比14mL/g、17mL/g、20mL/g這3個水平進行響應面試驗。

(3)BBD響應面法優(yōu)化三顆針多糖提取工藝

①回歸模型的建立

以D-E軟件設計的響應面試驗法案進行操作（3個平行操作），響應值考察三顆針多糖得率，結果如表2所示。

表2 響應面設計與結果Tab.2 Experimental design and test results of RSM

依據(jù)表2結果，Design-Expert軟件擬合回歸模型，擬合得到的模型公式為：Y=-2.66-0.018A+0.056B+0.004 5C+0.00017AB-0.0014AC+0.0002BC+0.00058A2-0.00037B2-0.00011C2。

擬合后得到的回歸模型的方差分析見表3。上述回歸模型的F值和P值分別是15.28和0.0008，P＜0.01，達到極顯著水平；失擬項P=0.7801＞0.05，表明模型失擬項不顯著；校正系數(shù)R2=0.9516；以上表明該模型具有較高的可靠性，擬合效果良好，可正確反映各因素與響應值之間的變化關系，因此可利用該方程分析預測三顆針多糖得率隨相關因素變化的波動情況。表3中對回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知，一次項B、二次項B2、C2以及交互項BC系數(shù)的顯著性均小于0.05，一次項A、C、二次項A2以及交互項AB、AC系數(shù)的顯著性均大于0.05。B提取溫度對多糖得率影響最大，其次是A料液比，C提取時間對多糖得率影響最小，即試驗因數(shù)A、B、C對三顆針多糖得率的影響大小依次為：B＞A＞C。

表3 回歸模型的方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

②3D響應面圖和等高線圖分析

響應面圖和等高線圖可直觀反映兩自變量間的交互作用。在響應面圖中，如若兩自變量間交互作用對多糖得率影響程度越大，圖形越陡峭，反之亦然。在等高線圖中，如若兩變量間交互作用對多糖得率影響較顯著，此時等高線越密集且呈現(xiàn)橢圓形，反之亦然。分析結果見圖3-圖5。

由圖3可知，3D響應面圖顯示，隨提取溫度的升高和料液比的提高，多糖的得率逐漸增加直到峰值。在等高線圖中，與料液比軸線上相比，沿提取溫度軸線方向上，等高線呈現(xiàn)出相對密集的變化，表明與料液比相比，提取溫度對多糖得率的影響更顯著。然而，在試驗條件范圍內，兩個軸線上的等高線均不呈橢圓形，表明提取溫度和料液比的交互作用較弱，兩者對多糖得率的影響不顯著。

圖3 提取溫度和料液比對三顆針多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature and liquidto-material ratio on the yield of Barberry Root polysaccharide

由圖4可知，3D響應面圖顯示，隨提取時間的增加和料液比的提高，多糖的得率逐漸增加，當多糖得率隨兩變量上升到峰值后，多糖的得率隨之開始下降。等高線圖顯示，沿提取時間軸等高線變化或沿料液比軸等高線變化均表現(xiàn)無規(guī)律，且兩個軸線上的等高線不呈橢圓形，表明提取時間和料液比的交互作用較弱，兩者對多糖得率影響不顯著。

圖4 提取時間和料液比對三顆針多糖提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time and liquid-tomaterial ratio on the yield of Barberry Root polysaccharide

由圖5可知，3D響應面圖顯示，多糖的得率隨提取溫度和提取時間的增加而逐漸增加。當多糖得率上升到峰值后，多糖的得率表現(xiàn)出緩慢的下降趨勢。等高線圖顯示，與提取時間軸線相比，在提取溫度軸線方向上，等高線呈現(xiàn)出相對密集的變化，表明與提取時間相比，提取溫度對多糖得率的影響比更加顯著。等高線在試驗條件范圍內呈橢圓形，表明提取溫度和提取時間交互作用較強，對多糖得率影響顯著。

圖5 提取溫度和提取時間對三顆針多糖提取率的影響Fig.5 Effects of extraction temperature and extraction time on the yield of Barberry Root polysaccharide

(4)三顆針多糖的紫外掃描圖譜

如圖6所示，三顆針多糖在260nm處無吸收峰，而280nm處有弱吸收峰，表明該三顆針多糖中含有蛋白[23-24]，無核酸，推測該粗提物中含有蛋白聚糖。

圖6 三顆針多糖紫外全波長掃描Fig.6 UV spectrogram of Barberry Root polysaccharide in 200-900nm

(5)三顆針多糖的紅外圖譜

如圖7所示，該提取物在3420.00cm-1處有一處寬的吸收峰，是多糖分子間或分子內O-H的伸縮振動吸收峰；2925.56cm-1處為不對稱C-H伸縮振動引起的吸收峰；這兩個峰為多糖的特征峰，即表明該提取物為三顆針多糖。1400-1200cm-1處的吸收峰是C-H的變角振動，1073.76cm-1處的吸收峰是吡喃糖環(huán)的醚鍵C-O-C的吸收峰[25-26]。其他峰有待進一步研究確證。

圖7 三顆針多糖400-4000cm-1紅外圖譜Fig.7 FTIR of Barberry Root polysaccharide

3.結論

本試驗考察料液比、提取溫度、提取時間3個因素對三顆針多糖得率的影響，在單因素試驗篩選的前提下，響應面法設計試驗，軟件優(yōu)化三顆針多糖的提取工藝為：液料比20mL/g，提取時間98.09min，提取溫度100℃，在此條件下三顆針多糖的提取率預測值為0.493%。根據(jù)操作的可行性調整三顆針多糖提取最佳工藝為：液料比20mL/g，提取時間100min，提取溫度100℃。在調整后的工藝條件下三顆針多糖實際提取率（0.476±0.022）%。建立的模型擬合程度是比較好的，試驗的誤差是比較小的，而且適用率是比較高的，是可以用來優(yōu)化預測和觀察三顆針多糖的最佳提取工藝，為獲得經濟、簡單、穩(wěn)定、可行的三顆針多糖提取工藝提供了參考的依據(jù)，為三顆針多糖的新型獸藥和飼料添加劑的研發(fā)提供資料支撐。