＊夏江 張文君,2,3* 公延灼 楊晨曦

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 黑龍江 150076 2.抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心 黑龍江 150076 3.黑龍江省預(yù)防與治療老年性疾病藥物研究重點實驗室 黑龍江 150025）

白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）化學(xué)名3,5,4，-三羥基二苯乙烯，是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的天然非黃酮類酚化多合物，存在于藜蘆、虎杖等藥材中，也存在于葡萄、桑葚等食物中。RSV以反式異構(gòu)體和順式異構(gòu)體2種形式存在，反式異構(gòu)體生物活性更強(qiáng)但在紫外光照射下易轉(zhuǎn)化為順式異構(gòu)體。RSV作為一種廣泛存在于多種植物、食品和治療補(bǔ)充劑中的天然多酚化合物[1-2]。但其難溶于水、穩(wěn)定性差，其在腸道及腎臟中發(fā)生大量代謝，阻礙了白藜蘆醇在體內(nèi)發(fā)揮藥物的活性，口服制劑吸收率雖然較高，但在體內(nèi)生物利用度較低，限制了RSV的開發(fā)應(yīng)用[3-4]。納米粒（nanoparticles，NPs）由外殼、內(nèi)核和活性物質(zhì)組成，具有“核-殼”結(jié)構(gòu)。其外殼材料決定穩(wěn)定性、生物半衰期等性能，而內(nèi)核決定納米粒負(fù)載的藥物類型。納米?？赏ㄟ^載體對藥物的包封作用實現(xiàn)緩釋及靶向目的，NPs較常規(guī)制劑有諸多優(yōu)勢，首先，其可通過不同載體材料及配比，實現(xiàn)藥物的緩釋和靶向，減少藥物的不良反應(yīng)；其次，其粒徑小、比表面積大且高度分散，可使藥物的滯留時間延長，從而促進(jìn)了藥物的吸收并提高了生物利用度；此外，載體所形成的封閉環(huán)境，提高了藥物的生物活性和穩(wěn)定性。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]是一種常用的可降解的納米載體材料，適用于包裹脂溶性藥物[5-6]。聚氰基丙烯酸正丁酯（polybutyl-cyanoacrylate，BCA）因具有可降解性、生物相容性、緩控釋和靶向性等特點成為藥物傳輸系統(tǒng)的熱點[7-9]，通過BCA載藥入腦，具備有諸多優(yōu)勢。

本實驗將通過改良后的乳化溶劑揮發(fā)法[10-11]和界面縮聚法[12-13]，制備以BCA-PLGA為載體的BCA-PLGA雙包載白藜蘆醇納米粒，通過單因素試驗和正交設(shè)計優(yōu)化處方工藝，以期制備包封率和載藥量較高的RSV-BCA-PLGA納米粒，為白藜蘆醇納米載藥系統(tǒng)的進(jìn)一步研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1.實驗部分

(1)儀器與試劑

儀器：LE204E/02電子天平；79-2型雙向磁力攪拌器；安東帕激光粒徑測定儀Litesizer?500；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；UV-2021 PC型紫外可見分光光度計。

試劑：白藜蘆醇對照品；白藜蘆醇；鹽酸；甲醇（分析純）；PLGA；聚乙烯醇；聚氰基丙烯酸正丁酯；氫氧化鈉（分析純）。

(2)實驗過程

①RSV-BCA-PLGA納米粒的制備工藝

采用改良后的乳化溶劑揮發(fā)法結(jié)合界面縮聚法制備RSV納米粒[14]。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、pH為5的PVA的水溶液30ml，作為水相；精密稱量處方量的RSV、BCA和PLGA，使用2ml丙酮有機(jī)相溶解，作為有機(jī)相。向水相中緩慢加入有機(jī)相，并以600r·min-1的轉(zhuǎn)速在室溫條件下磁力攪拌1h，以濃度為0.1mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7，完全除盡有機(jī)溶劑后，過0.45μm濾膜，即得RSV-BCA-PLGA納米粒。

②RSV-BCA-PLGA納米粒的包封率和粒徑的測定

A.紫外分光光度法

精密稱取10mg的RSV對照品制備濃度為1.0mg/ml的儲備液，從中分別吸取0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml，并用甲醇稀釋定容于10ml容量瓶中，配制得到一系列梯度濃度為1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、12μg/ml的對照液，測定吸光度A，檢測波長為306nm，以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

B.RSV-BCA-PLGA納米粒包封率的測定

精密量取1ml RSV-BCA-PLGA納米?；鞈乙褐糜诔瑸V離心管中，在15000r·min-1的轉(zhuǎn)速條件下離心20min，精密量取200μl外管液并用甲醇稀釋定容至10ml容量瓶中，按a項下方法測定RSV的游離成分的含量；精密量取RSV-BCA-PLGA納米?；鞈乙?00μl并用甲醇破乳定容至10ml容量瓶中，同法測定RSV-BCA-PLGA納米粒中RSV的總含量，計算納米粒中RSV的包封率。

C.RSV-BCA-PLGA納米粒粒徑的測定

取一定量的RSV-BCA-PLGA納米?；鞈乙海眉兯♂?，在室溫條件下用激光粒徑測定儀測定粒徑及其粒徑分布。

③RSV-BCA-PLGA納米粒的處方篩選

A.水相pH的確定

結(jié)合體內(nèi)胃腸道不同pH梯度，配制pH1.2、pH2、pH4.5、pH5.4、pH6.8至pH7.8的水溶液，其他組分的處方量不變，平行制備RSV-BCA-PLGA納米粒。

B.PVA型號及濃度的確定

以PVA的聚合度為依據(jù)，考察PVA05-88和PVA17-88兩種型號及濃度對制備RSV-BCA-PLGA納米粒的影響，固定pH為5.4，溶液中其他組分的含量保持不變。

C.PLGA濃度的確定

選用濃度為1%的PVA（17-88），pH值為5.4，保證其他處方用量不變，考察PLGA濃度為1%、2%和3%對RSV-BCA-PLGA納米粒粒徑和包封率的影響。

D.BCA濃度的確定

選用1%濃度的PVA（17-88），pH值為5.4，PLGA濃度為2%，其他組分處方量保持不變，考察不同濃度的BCA丙酮溶液對RSV-BCA-PLGA納米粒粒徑和包封率的影響。

E.PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比

選用1%濃度的PVA（17-88），pH值為5.4，PLGA濃度為2%，BCA濃度為0.75%，其他組分處方量保持不變，考察PLGA、BCA有機(jī)相加入體積對RSV-BCA-PLGA納米粒粒徑和包封率的影響。

F.有機(jī)相和水相體積比

選用1%濃度的PVA（17-88），pH值為5.4，PLGA濃度為2%，BCA濃度為0.75%，VPLGA:VBCA比例為1:1，其他組分處方量保持不變，考察有機(jī)相和水相體積比對RSV-BCA-PLGA納米粒粒徑和包封率的影響。

④優(yōu)化處方納米粒的表征

對3批RSV-BCA-PLGA納米粒進(jìn)行包封率和粒徑進(jìn)行測定。

2.結(jié)果與討論

(1)含量測定方法的建立結(jié)果

經(jīng)計算，得到RSV在2.5～20μg范圍內(nèi)的線性回歸方程為A=0.0435C-0.0036（r2=1），線性關(guān)系良好。

(2)RSV-BCA-PLGA納米粒的處方篩選

①水相pH的確定結(jié)果

包封率和粒徑測定結(jié)果表明，pH對包封率的影響較大，pH在1.2-5.4的范圍內(nèi)，隨著pH增大包封率增大，由36.02%增大到40.36%，分析原因可能是隨著pH增大，RSV的溶解度的變化趨勢整體呈現(xiàn)為先增加后減小，而在pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中，RSV溶解度最大[14]，藥物在未被聚合物包裹之前便已溶解，因此導(dǎo)致包封率有所下降，降至37.14%。pH對粒徑的影響是隨著pH增大粒徑變小，但影響不大，pH5.4時，粒徑為289.9nm。綜合粒徑及包封率的結(jié)果確定pH為5.4。

②PVA型號及濃度的確定結(jié)果包封率和粒徑測定結(jié)果見表1。

表1 PVA型號及濃度對納米粒粒徑和包封率的影響（n=3）

由表1可知，相比同一濃度不同型號的PVA，采用PVA-0588制備的RSV-BCA-PLGA的粒徑比PVA-1788的小，但包封率較低，因此選用PVA-1788進(jìn)行制備。隨著不斷增大PVA濃度，粒徑和包封率也逐漸增大，但當(dāng)PVA濃度增大至3%時，在制備過程中針孔附近易發(fā)生聚集，分析聚集原因可能是PVA的濃度過大，使體系粘度增大，降低了有機(jī)相進(jìn)入水相的速度，不易擴(kuò)散，聚集成球。綜合粒徑與包封率結(jié)果，確定PVA-1788溶液濃度為1%。

③PLGA濃度的確定結(jié)果

不同濃度的PLGA不會對納米粒的粒徑造成較大的影響，粒徑在243.4nm至248.5nm范圍內(nèi)，但包封率在PLGA濃度為2%時最大為75.21%。原因可能是當(dāng)PLGA濃度過高時，有機(jī)相粘度增大，阻礙了RSV在納米液滴中的分散，導(dǎo)致包封率降低，粒徑增大。綜合考慮粒徑與包封率最優(yōu)結(jié)果，確定PLGA溶液濃度為2%。

④BCA濃度的確定結(jié)果

隨著BCA濃度的增加（0.5%、0.75%、1%），RSV-BCAPLGA粒徑增加（232.5nm、221.8nm、282.2nm），BCA濃度原因可能隨著BCA濃度的增加，可加速單位體積與水中OH-的聚合，從而不易擴(kuò)散，多余的BCA在納米粒附近發(fā)生聚集致使粒徑增大。但包封率差異較小（73.81%、76.67%和72.69%），綜合考慮包封率與粒徑的結(jié)果確定BCA濃度為0.75%。

⑤PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比結(jié)果

通過改變PLGA和BCA有機(jī)相的體積比（1:0.5、1:1、1:2）對包封率的影響較?。?4.91%、77.01%、73.25%），但粒徑隨著BCA體積的增加逐漸增大，可能是由于BCA首先與水中OH-發(fā)生聚合反應(yīng)，當(dāng)藥物包封后，額外的BCA再繼續(xù)與OH-發(fā)生聚合反應(yīng)，多次重復(fù)包封導(dǎo)致粒徑進(jìn)一步增大（230.1nm、215.6nm、241.6nm），綜合考慮包封率與粒徑的結(jié)果確定PLGA、BCA所加入的有機(jī)相的體積比1:1。

⑥有機(jī)相和水相體積比

改變有機(jī)相和水相的比例（1:10、1:20、1:30）對納米粒的粒徑的變化幾乎沒有太大影響，但隨著水相比例的增大，包封率隨之增加（76.95%、79.45%、81.16%），可能是在通過注射器液下注入有機(jī)相的時候，水相比例增大的同時也增大了有機(jī)相與水相之間的接觸面積和載體與水相之間的聚合幾率。綜合考慮包封率與粒徑的結(jié)果，確定有機(jī)相與水相比例為1:30。

(3)處方的確定

根據(jù)處方篩選結(jié)果可得最優(yōu)處方：PVA（17-88）濃度為1%，體系pH為5.4，PLGA濃度為2%，BCA濃度為0.75%，PLGA、BCA有機(jī)相加入體積比為1:1，有機(jī)相和水相體積比為1:30。

(4)優(yōu)化處方納米粒的表征

①RSV-BCA-PLGA納米粒的包封率

按照1.2.2中B項下方法測定經(jīng)優(yōu)化處方制備的3批納米粒的包封率，結(jié)果見表2。

表2 不同批次白藜蘆醇納米粒包封率（n=3）

②RSV-BCA-PLGA納米粒的粒徑測定

取一定量RSV-BCA-PLGA納米粒，甲醇充分稀釋后，在室溫下測定粒徑及其粒徑分布，結(jié)果見圖1。

圖1 RSV-BCA-PLGA的粒徑圖由圖1可知，RSV-BCA-PLGA納米粒平均粒徑為219.7nm。

3.討論

近年來，藥物的發(fā)展不再局限于傳統(tǒng)的藥物劑型，納米劑型愈發(fā)受到研究人員的關(guān)注。在本文中，我們通過改良的乳化溶劑揮發(fā)法和界面縮聚法制備RSV-BCA-PLGA納米粒[14]，選用的藥物載體材料為低毒、具有生物可降解性和緩控釋等特點的PLGA與BCA，可在提高藥物生物利用度的同時實現(xiàn)藥物的控釋和靶向。若單獨(dú)使用BCA，考慮到在酸性條件下的BCA會發(fā)生聚合反應(yīng)，使RSV-BCA-PLGA納米粒的包封率隨pH值的升高而降低；若單獨(dú)使用PLGA則無法達(dá)到靶向藥物的作用。PLGA可增強(qiáng)體系的黏度，進(jìn)而減緩水相中藥物的溶出速度，延長藥物進(jìn)入水相的時間，故選擇BCA與PLGA合用，PLGA首先將RSV包裹后，再與BCA發(fā)生聚合反應(yīng)，有效避免了藥物因酸性環(huán)境而發(fā)生溶解的特性；同時，通過BCA與PLGA的合用，還可發(fā)揮BCA的靶向遞藥作用。制備得到包封率、載藥量較高的BCA-PLGA納米粒，為研究白藜蘆醇納米給藥系統(tǒng)研究提供參考。