＊董祎琳 單愛萍

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 271018 2.山東省認(rèn)證認(rèn)可協(xié)會(huì) 山東 250002）

土壤在生態(tài)環(huán)境體系中是相當(dāng)復(fù)雜的，作為微生物學(xué)的一個(gè)分支，土壤微生物學(xué)是我們始終在研究的一個(gè)學(xué)科。土壤的重要組成部分之一便是土壤微生物，是生態(tài)系統(tǒng)中缺一不可的“消費(fèi)者”和“分解者”，土壤的質(zhì)量和穩(wěn)定性通常會(huì)通過群落結(jié)構(gòu)的多樣性以及變化反映出來。人類大量地進(jìn)行地下煤炭的開釆勢(shì)必會(huì)對(duì)地表造成損害，其中地表嚴(yán)重變形、地面沉陷是最常見和最主要的表現(xiàn)。地面沉陷過程實(shí)際是對(duì)土壤強(qiáng)烈干擾的過程，沉陷中土壤的基本性質(zhì)，如土壤結(jié)構(gòu)、土壤質(zhì)地、容重，甚至土體構(gòu)型都在發(fā)生劇烈變化，隨之造成土壤水、肥、氣、熱、生物等環(huán)境因子發(fā)生變化，以致土壤生態(tài)發(fā)生劇烈變化。

我國東部高潛水位礦區(qū)大多臨近城市，并且采煤沉陷地帶多出現(xiàn)在耕地區(qū)域，因此，無論是基于生態(tài)治理的需要，還是對(duì)保護(hù)耕地的考慮，沉陷土壤的化學(xué)特征變化都是重要的研究對(duì)象。我國原有煤礦地區(qū)由于常年開采已經(jīng)導(dǎo)致塌陷深度和面積越來越大，因此，近些年以來，各地政府部門陸續(xù)制定了很多采煤沉陷區(qū)綜合治理生態(tài)修復(fù)方案，但是由于財(cái)力有限，形成一種瓶頸制約。本文擬在研究地面沉陷規(guī)律的基礎(chǔ)上，通過沉陷過程中土壤生態(tài)因子的變化揭示土壤生態(tài)變化過程，為礦區(qū)土壤修復(fù)提供技術(shù)支撐。

1.高通量測(cè)序技術(shù)概述

(1)高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)（High-Throughput Sequencing，HTS）的主要特征是能一次并行對(duì)幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。高通量測(cè)序技術(shù)號(hào)稱序列檢測(cè)技術(shù)發(fā)展歷史的一座里程碑，該技術(shù)能夠?qū)?shù)百億個(gè)DNA分子實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)。這使對(duì)某個(gè)生物的轉(zhuǎn)錄組和基因組作出更詳細(xì)全貌的解析具有可能性，所以我們稱它為深度測(cè)序（deepsequencing）或下一代的序列檢測(cè)技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）。目前，所謂的高通量測(cè)序科技主要是由454 Life Sciences公司、ABI公司和Illumina公司所提出的第二代序列檢測(cè)科技以及Helicos HeliscopeTM和Pacific Biosciences提出的單原子測(cè)序科技。

高通量測(cè)序科技的三個(gè)優(yōu)勢(shì)都是傳統(tǒng)Sanger檢測(cè)科技法所不具有的。首先，由于使用芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，能夠在數(shù)百億個(gè)點(diǎn)上同步讀取檢測(cè)結(jié)果，將平行數(shù)據(jù)處理的思路用到最大，所以又叫做大規(guī)模平行檢測(cè)科技（Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS），這也是為大多數(shù)人們所熟悉的。其次，高通量測(cè)序科技具有完整的定量分析功能，這也就是樣本中一種DNA被通過檢測(cè)科技的次數(shù)，反映了樣本中這種DNA的豐富程度，能夠替代以前的基因組表達(dá)芯片技術(shù)進(jìn)行對(duì)基因組表達(dá)的研究。第三，生產(chǎn)成本比較低。使用傳統(tǒng)Sanger測(cè)序法所進(jìn)行的人類基因組規(guī)劃總共花費(fèi)了27億美金，盡管比預(yù)期的30億美金節(jié)約了很多時(shí)間，但仍然是一項(xiàng)花費(fèi)相當(dāng)龐大的系統(tǒng)工程。但現(xiàn)在使用高通量測(cè)序技術(shù)完成的人類基因體測(cè)序技術(shù)，總花費(fèi)還不足于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的1%。

(2)高通量測(cè)序技術(shù)在微生物多樣性中的應(yīng)用

微生物多樣性采用高通量測(cè)序技術(shù)中的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面：

①利用高通量測(cè)序技術(shù)研究土壤中微生物的結(jié)構(gòu)和種類多樣性

近些年生物檢測(cè)技術(shù)更新和發(fā)展速度很快，可以利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)土壤微生物細(xì)胞中的原核細(xì)菌（16SrRNA）。在這種特定的基因產(chǎn)物中有一種特定的保守進(jìn)化主義。大小相同的土壤微生物會(huì)共享保守區(qū)的序列。但是，進(jìn)化過程中物種和序列會(huì)發(fā)生變化，在保守序列中同樣會(huì)存在不同的區(qū)域。因此，通過測(cè)試和對(duì)比序列的可變區(qū)域，人們探討并發(fā)現(xiàn)了土壤微生物種類多樣化和種群結(jié)構(gòu)多樣化，使得許多專家和研究者能夠更深入發(fā)掘土壤中多樣化的微生物種群結(jié)構(gòu)。

②利用高通量測(cè)序技術(shù)可探索土壤中微生物功能的多樣性

mRNA是制造蛋白質(zhì)和生物活性酶的中間物質(zhì)，因此，mRNA和相應(yīng)的DNA具有完全互補(bǔ)的序列。為了更好地分析土壤中微生物的活性、土壤細(xì)菌之間的相互調(diào)節(jié)功能以及土壤細(xì)菌的功能多樣性，人們通常對(duì)土壤細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組mRNA進(jìn)行測(cè)序。

③利用高通量測(cè)序技術(shù)還可研究土壤中微生物遺傳的多樣性

土壤細(xì)菌群落與其他環(huán)境微生物群落相比，具有更高的生物多樣性和更復(fù)雜的種群結(jié)合成分。然而，宏基因組高通量測(cè)序有助于更廣泛地挖掘土壤中微生物基因遺傳多樣化。

2.利用16SrRNA對(duì)高潛水區(qū)煤礦區(qū)地表沉陷過程中土壤研究

針對(duì)已經(jīng)穩(wěn)沉的沉陷地，從煤層厚度和埋深、單一煤層和多煤層3個(gè)方面選擇典型區(qū)域，根據(jù)前面劃分的沉陷階段，選擇相應(yīng)位置分別采集相關(guān)數(shù)據(jù)。采樣深度分別為0-20cm、20-40cm、40-60cm。通過分別對(duì)塌陷前與塌陷后的微生物進(jìn)行測(cè)序形成對(duì)照組，一個(gè)處理進(jìn)行五個(gè)重復(fù)。得到shannon、simpson、chao1、observed四個(gè)多樣性指數(shù)的數(shù)值。shannon指數(shù)是生物量豐富度，指數(shù)越大，多樣性越高；simpson指數(shù)是生物種類覆蓋度，群落多樣性越高，simpson值越大；chao1指數(shù)是用chao1可用于估算樣品中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，數(shù)值越大則樣本中所含物種就越多。observed代表OTUs的直觀統(tǒng)計(jì)。

3.研究結(jié)果

(1)從箱式圖上看

圖1 chao1指數(shù)微生物多樣性箱式圖

圖2 shannon指數(shù)微生物多樣性箱式圖

箱式圖是一種描述數(shù)據(jù)分布的統(tǒng)計(jì)圖，它能簡單表達(dá)出數(shù)據(jù)是否具有分布以及對(duì)稱性的分散程度。地表無論是塌陷前還是塌陷后，微生物多樣性指數(shù)之間的差異都不顯著，說明微生物多樣性與土壤深度雖有關(guān)系，但并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這或許與檢測(cè)微生物種類太少或采樣重復(fù)次數(shù)不夠有關(guān)。塌陷后微生物多樣性的垂直變化規(guī)律消失，不同土壤深度的微生物多樣性不再有明顯差異，礦坑塌陷以后微生物沿土壤剖面的空間尺度變化被打破，微生物多樣性降低。原因上，可能是高潛水位塌陷區(qū)土壤鹽漬化嚴(yán)重，養(yǎng)分流失，抑制微生物生長。

圖3 simpson指數(shù)微生物多樣性箱式圖

圖4 observed指數(shù)微生物多樣性箱式圖

(2)從散點(diǎn)趨勢(shì)圖看

圖5 observed指數(shù)微生物多樣性散點(diǎn)圖

圖6 shannon指數(shù)微生物多樣性散點(diǎn)

散點(diǎn)圖將序列顯示為一組點(diǎn)，可以表示因變量隨自變量而變化的大致趨勢(shì)，據(jù)此可以選擇適宜的函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行擬合。地表塌陷前，隨著深度的增加，simpson指數(shù)有減小趨勢(shì)，說明隨著土壤深度微生物多樣性越低。chao1指數(shù)有減小趨勢(shì)，說明隨著土壤深度微生物物種總數(shù)越少。shannon值有減小趨勢(shì)，說明群落多樣性越低。

塌陷后反之，隨著深度的增加，simpson指數(shù)有增加趨勢(shì)，說明隨著土壤深度微生物多樣性越高。chao1指數(shù)有增加趨勢(shì)，說明隨著土壤深度微生物物種總數(shù)越多。shannon值有增大趨勢(shì)，說明群落多樣性越高。

圖7 simpson指數(shù)微生物多樣性散點(diǎn)圖

圖8 chao1指數(shù)微生物多樣性散點(diǎn)圖

治理上，土壤微生物的豐富度和多樣性指數(shù)可以反映出土壤生態(tài)的恢復(fù)程度，為礦區(qū)恢復(fù)提供理論支撐和評(píng)價(jià)指標(biāo)。

在基因組學(xué)研究領(lǐng)域，高通量測(cè)序技術(shù)的誕生是一個(gè)具有里程碑意義的事件。第二代高通量測(cè)序技術(shù)在研究微生物群落結(jié)構(gòu)方面提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)，并在研究領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用和認(rèn)可。與第一代測(cè)序技術(shù)相比，第二代高通量測(cè)序技術(shù)使得核酸測(cè)序的單堿基成本急劇下降。在已完成基因組序列測(cè)定的物種中，對(duì)該物種的其他品種進(jìn)行大規(guī)模的全基因組重測(cè)序也成為了可能。

4.結(jié)語

礦山開采活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致地下形成采空區(qū)，地表也會(huì)形成沉降和塌陷，繼而造成地下水流失，長期下去會(huì)對(duì)農(nóng)作物生長帶來不利影響。以上實(shí)驗(yàn)分析雖然明確指出了地面沉陷對(duì)土壤微生物和多樣性指數(shù)的影響，但尚未系統(tǒng)的闡明采煤沉陷全生命周期的土壤地球化學(xué)因子變化的過程，沉陷后土壤的長期演化規(guī)律也有待探究。在沉陷區(qū)域利用高通量測(cè)序和16s技術(shù)進(jìn)行采煤沉陷全生命周期土壤生態(tài)過程的研究，有助于了解礦區(qū)獨(dú)特生態(tài)系統(tǒng)下的土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，更加清晰認(rèn)識(shí)到釆礦活動(dòng)對(duì)土壤生態(tài)過程的影響，以填補(bǔ)國內(nèi)研究對(duì)煤礦區(qū)土壤生態(tài)過程研究的空白。