張文華，唐富波，胡 森，杜明華解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新部 創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 0085；武警四川總隊(duì)醫(yī)院 燒傷科，四川樂山 64000；解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 急診科，北京 0085

嚴(yán)重?zé)齻?，全身炎癥反應(yīng)和微血管通透性增高引起血管內(nèi)液體向組織中滲漏，是組織水腫和低血容量性休克的主要原因。同時(shí)，血管內(nèi)皮屏障受損導(dǎo)致液體復(fù)蘇過程中大量血管內(nèi)液體進(jìn)入組織及空腔臟器，減少血液循環(huán)量，加重組織水腫和臟器功能損傷，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征及高病死率[1-2]。組蛋白的乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中重要的組成部分，在失血性休克條件下，機(jī)體去乙酰化增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂甚至死亡[2]。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACIs)能夠抑制細(xì)胞的高度去乙?；剑诜肿铀缴咸岣呒?xì)胞對致死性損傷的耐受能力，并可以減輕缺血缺氧引起的心、腦、腎等重要臟器的損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn)HDACIs能提高缺氧損傷心肌細(xì)胞拮抗缺氧的能力，應(yīng)用于嚴(yán)重燙傷、膿毒性休克和失血性休克動(dòng)物模型中，可以提高機(jī)體抗炎癥、抗缺氧、抗休克等能力，保護(hù)其重要臟器功能[4-5]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種高度特異性的血管內(nèi)皮有絲分裂素，其可以特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞中的受體，在血管內(nèi)皮通透性調(diào)節(jié)中起到重要作用[6-7]。近期研究表明，HDACIs能在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中抑制VEGF的表達(dá)[8]。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種組蛋白去乙?；敢种扑幬?，研究表明在失血性休克和膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中丙戊酸鈉可以修復(fù)組蛋白的乙?；剑瑴p少重要臟器損傷，提高動(dòng)物存活率。近年的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重?zé)隣C傷動(dòng)物模型中，丙戊酸鈉可以保護(hù)腦、心臟和腸道等重要臟器的功能，提高存活率[9-11]。本研究將觀察丙戊酸鈉對50% TBSA Ⅲ度燙傷大鼠模型肺微血管內(nèi)皮屏障是否具有保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 丙戊酸鈉購自Selleck公司，VEGF、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和H3K9 ELISA試劑盒購自北京依科賽公司，甲酰胺購自Sigma公司，分光光度計(jì)購自賽默飛公司(NanoDrop Lite)。恒溫干燥箱購自丹泊儀器(昆山)有限公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自德國Biosys公司 (Bioreader)。

2 動(dòng)物模型與分組 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)的批準(zhǔn)并嚴(yán)格依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)的規(guī)定及相關(guān)推薦進(jìn)行。清潔級雄性SD大鼠64只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，60～70 d齡，體質(zhì)量(250 ± 10) g。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，4 h禁飲。隨機(jī)分配為4組：1)NN組(n=16)，假燙后即刻腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液(100 mg/kg)；2)NV組(n=16)，假燙后即刻腹腔內(nèi)注射丙戊酸鈉(300 mg/kg，100 mg/mL 0.9%氯化鈉注射液)；3)SN組(n=16)，燙傷后即刻腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液(100 mg/kg)；4)SV組(n=16)，燙傷后即刻腹腔內(nèi)注射丙戊酸鈉(300 mg/kg，100 mg/mL 0.9%氯化鈉注射液)。腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉注射液(50 mg/kg)麻醉滿意后，背、腹部皮膚備皮；燙傷組在100℃水溫下燙傷背部15 s、腹部8 s；假燙組在37℃水溫下浸泡背部15s、腹部8s。燙傷/假燙后立即擦干皮膚水分并予相應(yīng)治療措施，燙傷后2 h和6 h取材。于各觀察點(diǎn)前30 min麻醉大鼠，頸靜脈注射2%伊文思藍(lán)(20 mg/kg，20 mg/mL)，30 min后開胸，自心尖部置入沖洗管并固定，剪開右心耳，灌注37℃保存的1‰肝素鹽水，沖洗至灌出液清亮 后，取肺組織放置于液氮中待測。

3 分光光度法測定肺微血管內(nèi)皮通透性 取沖洗凈血液及殘余EB的肺組織0.2 g，裝入含有2 mL甲酰胺的試管中，放置于37℃恒溫水浴箱中24 h，1 500 g離心30 min，提取上清液，分光光度計(jì)于620 nm，1 cm光徑比色皿檢測吸光度值，根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)EB含量。

4 干濕重法測定肺組織含水率 在吸水紙上吸去肺組織表面水分后，剪取適量新鮮肺組織，稱濕重，置于90℃恒溫干燥箱中，取出標(biāo)本稱干重( D)。肺組織含水率(%)=(W - D)/W × 100%。

5 分光光度法檢測肺組織MPO活性 準(zhǔn)確稱量肺組織，以配好的試劑二溶液為勻漿介質(zhì)，按照重量體積比1∶19加入勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿，不需要進(jìn)行離心；取5%組織勻漿0.9 mL加3號(hào)試劑0.1 mL，充分混勻后37℃水浴15 min，取出后待測；混勻，60℃水浴10 min，取出后立即用分光光度計(jì)于460 nm處，1 cm光徑比色皿，雙 蒸水調(diào)零，檢測各管吸光度值。

6 ELISA法測定肺組織中VEGF和Ac-H3K9含量 固定時(shí)間點(diǎn)取組織后，立即置于液氮中。反復(fù)凍融3次后，取0.3 g組織加入0.5 mL組織裂解液，研磨后1 500 g離心5 min，取上清，凍存于-20℃冰箱中待檢測。常溫融化上清和ELISA試劑盒后，按照說明書要求，檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。向試劑盒中加入100 μL上清，蓋上貼紙，在避光 37℃下反應(yīng)1 h。300 μL洗液洗板5次。加入底物反應(yīng)液100 μL，避光、室溫、搖床上反應(yīng)30 min，棄去上清，洗板5次，加入HRP反應(yīng)液100 μL，反應(yīng)15 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度，并計(jì)算樣 品濃度。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0 .05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織微血管通透性與含水率 與假燙組相比，大鼠燙傷后2 h即出現(xiàn)肺伊文思藍(lán)含量增高(P＜ 0.05)，燙傷后6 h增高更為顯著(P＜ 0.05)；與NS組相比，SV組大鼠肺伊文思藍(lán)含量在燙傷后2 h時(shí)無明顯差異，在燙傷后6 h時(shí)明顯降低(P＜ 0.05)。說明丙戊酸鈉能夠緩解嚴(yán)重燙傷引起的肺微血管內(nèi)皮通透性增高。與假燙組大鼠相比，燙傷組大鼠燙傷后2 h肺組織含水率升高(P＜ 0.05)，燙傷6 h顯著升高(P＜ 0.05)。與SN組比較，SV組肺組織含水率在燙傷2 h和燙傷6 h時(shí)均有所降低(P均 ＜ 0.05)。說明VPA能夠降低嚴(yán)重燙傷引起 的肺組織水腫。見表1。

表1 丙戊酸鈉對燙傷后肺組織微血管通透性和含水率的影響Tab. 1 Effect of sodium valproate on microvascular permeability and water content of lung tissue after scald

2 肺組織VEGF含量、MPO活性和Ac-H3K9表達(dá) 與假燙大鼠比較，SN組和SV組大鼠VEGF水平在2 h和6 h時(shí)均明顯增高(均P＜ 0.05)。燙傷2 h后，SV組與SN組VEGF水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；燙傷6 h后，SV組大鼠VEGF水平明顯低于SN組大鼠(P＜ 0.05)。說明VPA治療后能夠有效降低嚴(yán)重?zé)齻鸬姆谓M織VEGF水平增高，進(jìn)而降低非微血管通透性。與假燙大鼠相比，SN組和SV組大鼠MPO活性在燙傷2 h和6 h時(shí)均明顯增高(P均＜ 0.05)。與SN組比較，SV組大鼠肺MPO活性在6 h時(shí)明顯降低(P＜ 0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在燙傷2 h時(shí)兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明VPA能夠緩解嚴(yán)重燙傷引起的肺組織MPO活性升高。與NN組比較，燙傷2 h時(shí)，SN組Ac-H3K9水平開始下降(P＜ 0.05)，燙傷6 h時(shí)下降更為明顯(P＜ 0.05)。SN組大鼠肺組織Ac-H3K9水平在燙傷2 h時(shí)即恢復(fù)到高于正常水平(P＜ 0.05)，燙傷6 h時(shí)增高更為明顯(P＜ 0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 VPA對燙傷后肺組織VEGF含量、MPO活性和Ac-H3K9表達(dá)的影響Tab. 2 Effect of sodium valproate on VEGF content, MPO activity and Ac-H3K9 expression in lung tissue after scald

討 論

目前燒傷后早期救治工作的重點(diǎn)集中在如何維持組織灌注和保護(hù)重要臟器的功能[12]。然而，因燒傷后機(jī)體微血管內(nèi)皮屏障受到損傷，即使足量補(bǔ)充液體復(fù)蘇，仍可能導(dǎo)致一系列嚴(yán)重威脅燒傷患者生命的并發(fā)癥[13-14]。肺通常是嚴(yán)重?zé)齻笫紫仁艿綋p傷的器官之一，大部分燒傷患者甚至在沒有發(fā)生吸入性損傷和感染的情況下也會(huì)發(fā)生急性肺損傷和肺水腫。因此研究對燒傷后肺微血管內(nèi)皮屏障具有保護(hù)作用的藥物，對于減輕肺水腫、急性肺損傷及減少燒傷補(bǔ)液需求十分必要[15-17]。

本研究采用50% TBSA Ⅲ度燙傷大鼠模型探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑VPA對燙傷大鼠肺微血管內(nèi)皮屏障的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重燙傷后，大鼠肺微血管內(nèi)皮屏障被破壞，微血管內(nèi)皮通透性明顯增高，肺組織水腫。VPA治療后能保護(hù)燙傷引起的肺微血管內(nèi)皮屏障損傷，降低燙傷大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性，減輕組織水腫。

組蛋白的乙酰化修飾是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制之一。HATs和HDACs的在生理狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)平衡共同調(diào)節(jié)組蛋白的總體乙酰化水平，稱為“組蛋白的乙?；胶狻?。HDACIs是去乙?；富钚砸种扑幬?，可以降低組蛋白的去乙?；剑瑥亩呓M蛋白的乙?；?，保護(hù)細(xì)胞功能。研究表明，HDACIs能夠抑制失血性、膿毒癥等休克條件下細(xì)胞的去乙?；^程，恢復(fù)組蛋白的乙?；胶?，減輕缺血缺氧引起的心、腦、腎等重要臟器的損傷[3]。丙戊酸鈉是一種HDACIs類藥物[18]。研究表明，在失血性休克和膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，丙戊酸鈉可以修復(fù)組蛋白的乙?；?，減少重要臟器損傷，提高動(dòng)物生存率[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腹腔注射丙戊酸鈉后能夠明顯提高肺的組蛋白乙?；?；燙傷2 h后大鼠肺的組蛋白乙?；郊闯霈F(xiàn)降低，燙傷6 h后乙?；矫黠@降低；燙傷大鼠經(jīng)丙戊酸鈉治療后，在燙傷后2 h和6 h均能顯著提高組蛋白乙?；?。因此猜想丙戊酸鈉可能通過提高組蛋白乙酰化水平改善燙傷大鼠預(yù)后。

燒傷引起組織VEGF表達(dá)和MPO活性增加。HDACIs類藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中抑制VEGF表達(dá)水平[20]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠嚴(yán)重燙傷后肺組織VEGF表達(dá)增加，MPO活性增強(qiáng)，同時(shí)出現(xiàn)肺微血管內(nèi)皮通透性升高和肺水腫；嚴(yán)重燙傷大鼠經(jīng)丙戊酸鈉治療后，其肺組織VEGF表達(dá)和MPO活性相對低于燙傷大鼠，同時(shí)肺微血管通透性降低，肺水腫減輕。說明丙戊酸鈉通過抑制嚴(yán)重燙傷后VEGF的表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤，保護(hù)肺微血管內(nèi)皮屏障，降低肺微血管通透性和肺水腫。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重燙傷會(huì)導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮屏障的損害，與前人研究類似。丙戊酸鈉能夠?qū)勾瞬±磉^程并保護(hù)肺微血管內(nèi)皮屏障，從而改善燙傷后急性肺水腫等并發(fā)癥，其作用機(jī)制可能與丙戊酸鈉對VEGF和MPO的抑制作用有關(guān)。