徐麗群，張麗君，李高志，張曉雁，王藝璇，胡澤兵，曹新生，石 菲，張 舒

空軍軍醫(yī)大學 航空航天生物動力學教研室，航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西西安 710032

機械刺激在維持骨骼重塑和平衡中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。長期臥床休息或太空飛行會導致嚴重的骨質(zhì)流失，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥和骨折[3-4]。成骨細胞可以響應(yīng)機械刺激的變化，并轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)的生化信號調(diào)節(jié)基因表達，影響成骨細胞的增殖、分化和凋亡[5-6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶Ⅰ(silent information regulator 1，SIRT1)，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide +，NAD+)依賴性組蛋白去乙?；竻⑴c調(diào)控多種細胞功能，如細胞周期、晝夜節(jié)律、細胞衰老、血管生成、能量代謝等[7]。大量研究已表明SIRT1通過調(diào)控成骨細胞的增殖、分化及凋亡在骨骼發(fā)育和重塑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8-9]。但其能否在模擬失重下影響成骨細胞功能及上游調(diào)控機制尚不完全清楚。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，通過靶向mRNA抑制基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯發(fā)揮作用[10-11]。研究表明miRNA對骨穩(wěn)態(tài)和骨骼重塑至關(guān)重要，可通過激活或抑制大量與骨形成相關(guān)的基因和信號通路調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化和凋亡[5,10,12]。此外，已報道大量miRNA對失重敏感，并且對成骨細胞功能有顯著影響，如miR-132-3p、miR-139-3p、miR-320-3p等[13-15]。最近研究表明，miR-138-5p是一種機械敏感的miRNA，可以調(diào)節(jié)成骨細胞功能[16]。本研究以MC3T3-E1前成骨細胞為研究對象，檢測了SIRT1和miR-138-5p在模擬失重下的表達，探究失重性或廢用性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機制，為治療靶點的選擇提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 材料 小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1(中國科學院上海細胞庫)，α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青公司)，青-鏈霉素雙抗(Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，2D回轉(zhuǎn)器(中國航天員科研訓練中心)，mimic-138-5p、inhibitor-138-5p、si-SIRT1、pcDNA3.1(+)-SIRT1及相應(yīng)的陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，RNAiso Plus細胞裂解液，SYBR?Premix Ex TaqTM、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit(TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，M-PER哺乳動物蛋白抽提試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，預制膠(美國Invitrogen公司)，PVDF膜(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測試盒(南京建成生物工程研究所)，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(中國Beyotime公司)，qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(Merck Millipore公司)，PBS緩沖溶液(Gibco公司)，酶標儀(Bio-Rad公司)，化學發(fā)光儀(Tanon-4 200，上海天能科技有限公司)。

2 細胞培養(yǎng)和體外分化 用含有10%胎牛血清(Gibco)、1%青霉素和1%鏈霉素(Gibco)的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱(5% CO2，95%濕度)中常規(guī)培養(yǎng)小鼠前成骨細胞MC3T3-E1細胞系。為了研究成骨細胞分化，用成骨誘導培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MC3T3-E1細胞(成骨誘導培養(yǎng)基成分：10%胎牛血清，1%青霉素，1%鏈霉素，100 nmol/L地塞米松，50 μg/mL抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸)。實驗均用第8～12代的細胞，所有實驗重復 3次。

3 細胞模擬失重實驗 2D回轉(zhuǎn)器用于模擬地面細胞的失重環(huán)境，將MC3T3-E1細胞以5 × 105/瓶的密度接種在25 cm2專用回轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。細胞貼壁并融合后，在培養(yǎng)瓶中灌滿培養(yǎng)基并加塞，此過程確保完全去除氣泡。最后，將培養(yǎng)瓶置于2D回轉(zhuǎn)器，圍繞其水平軸以24 r/min旋轉(zhuǎn)24 h、48 h和72 h，獲得的細胞為失重組( Clino)。對照組(Con)置入37℃孵箱中普通培養(yǎng)。

4 細胞轉(zhuǎn)染 將MC3T3-E1細胞以適當?shù)拿芏葌髦亮装?，并用有血清無雙抗的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)過夜，當細胞密度為60%～80%時轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine 2000將miR-138-5p mimic (40 nmol/L)、miR-138-5p inhibitor (80 nmol/L)及其相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細胞中；使用Lipofectamine 3000，將pEX-SIRT1 (100 ng/μL)及陰性對照pEX分別轉(zhuǎn)染至細胞，無血清無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)6 ~ 8 h后 更換為有血清無雙抗培養(yǎng)基。

5 挽救實驗 將MC3T3-E1細胞以適當?shù)拿芏葌髦?5 cm2專用回轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，并用有血清無雙抗的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)過夜，當細胞密度為60%時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h后在培養(yǎng)瓶中灌滿培養(yǎng)基并加塞，將培養(yǎng)瓶置于2D回轉(zhuǎn)器并圍繞其水平軸以24 r/min旋轉(zhuǎn)48 h，獲得的細胞為失重組(Clino)。對照組( Con)置入37℃孵箱中普通培養(yǎng)。

6 實時熒光定量PCR 用RNAiso Plus裂解細胞并提取MC3T3-E1細胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)。使用Prime ScriptTMRT Master Mix Kit按照以下步驟對mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃保存；使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit按照以下步驟對miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄：37℃ 1 h，85℃ 5 min，4℃保存。以GAPDH或U6作為內(nèi)參。使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ和CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)通過qRT-PCR檢測mRNA的表達。PCR引物序列見表 1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

7 蛋白質(zhì)印跡分析 胰酶消化收集細胞后加入含有10%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取MC3T3-E1細胞總蛋白。超聲裂解后在4℃下12 000 r/min離心10 min，吸取上清即為蛋白樣品。使用PierceTMBCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒和紫外分光光度計進行蛋白定量。按照Western blot常規(guī)操作進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，用5%脫脂奶將膜封閉2 h，并在4℃下與特異性一抗孵育過夜。使用一抗如下：GAPDH(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，Runx2(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，Osx(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，SIRT1(1∶1 000；Proteintech，美國)。然后，將膜與二抗孵育2 h(1∶5 000；ZS-GB-BIO公司)，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用 Image J軟件進行灰度值分析。

8 堿性磷酸酶活性測定 將MC3T3-E1細胞胰酶消化收集后加入含有10%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，超聲裂解后在4℃下12 000 r/min離心10 min吸取上清。使用ALP檢測試劑盒檢測上清液中的ALP活性。上清液加入顯色劑37℃孵育15 min后，以苯酚為標準溶液，ddH2O作為空白對 照溶液測定溶液520 nm處的吸光度值。

9 堿性磷酸酶染色 使用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒進行堿性磷酸酶染色。細胞用PBS沖洗后用4%多聚甲醛固定15 min。將固定的細胞再次用PBS沖洗3次，然后將BCIP/NBT染色工作液加到每個孔中，室溫避光孵育30 min后用ddH2O洗 滌終止顯色反應(yīng)。數(shù)碼相機拍照。

10 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計分析均使用SPSS22.0軟件，計量數(shù)據(jù)以 xˉ± s表示，t檢驗用于兩樣本間比較，One-way ANOVA用于多樣本間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義 ，所有實驗均重復3次。

結(jié) 果

1 SIRT1在模擬失重下的表達 與Con組相比，模擬失重24 h、48 h、72 h后，qRT-PCR結(jié)果表明MC3T3-E1細胞中Runx2、SIRT1 mRNA的表達顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)(圖1A)，Western blot結(jié)果也顯示模擬失重48 h后SIRT1蛋白水平下 調(diào)(P＜0.01)(圖1B)。

圖1 模擬失重下MC3T3-E1細胞SIRT1的表達(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：模擬失重24 h、48 h、72 h后MC3T3-E1細胞的Runx2及SIRT1 mRNA表達；B：模擬失重48 h后MC3T3-E1細胞的SIRT1蛋白表達Fig.1 Expression level of SIRT1 in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con group)A: Runx2 and SIRT1 mRNA expression levels in MC3T3-E1 cells after simulated weightlessness for 24 h, 48 h and 72 h; B: SIRT1 protein expression level in MC3T3-E1 cells after simulated weightlessness for 48 h

2 miR-138-5p在模擬失重下表達上調(diào)并抑制骨分化 為了驗證miR-138-5p是否在模擬失重下差異表達且發(fā)揮作用，將MC3T3-E1細胞在2D回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后進行 檢測。qRTPCR結(jié)果表明，在模擬失重過程中，miR-138-5p水平升高(P＜0.05或P＜0.01)(圖2A)。為了探究miR-138-5p在成骨細胞分化中的作用，向成骨細胞中轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic、inhibitor或陰性對照。qRT-PCR結(jié)果表明，與mimic-NC組相比，mimic組Runx2、Osx、ALP mRNA水平表達顯著下降，且Runx2、Osx蛋白水平也顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)；與inhibitor-NC組相比，inhibitor組Runx2、Osx、ALP mRNA水平表達無明顯變化，但Runx2、Osx蛋白水平顯著上調(diào)(P＜0.01)(圖2B，圖2C)。ALP活性檢測及ALP染色檢測結(jié) 果與qRT-PCR、Western blot結(jié)果一致(圖2D)。

圖2 miR-138-5p在模擬失重下表達上調(diào)并抑制骨分化(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：模擬失重下MC3T3-E1細胞miR-138-5p的表達；B：轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic、inhibitor或陰性對照后Runx2、Osx及ALP的mRNA表達；C：轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic、inhibitor或陰性對照后Runx2和Osx蛋白的表達；D：ALP染色Fig.2 Expression level of miR-138-5p was up-regulated and then inhibited bone differentiation under simulated microgravity (aP ＜ 0.05, bP ＜0.01, vs Con group)A: Expression level of miR-138-5p in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity; B: mRNA expression levels of Runx2, Osx and ALP after transfection with mimic-138-5p, inhibitor-138-5p and negative control; C: Protein expression levels of Runx2 and Osx after transfection with mimic-138-5p, inhibitor-138-5p and negative control; D: Representative staining images of ALP in osteoblasts

3 miR-138-5p依賴SIRT1負調(diào)控成骨細胞分化 為了驗證miR-138-5p是否通過靶向SIRT1調(diào)節(jié)成骨細胞功能，將miR-138-5p mimic和pEXSIRT1或其陰性對照共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細胞中。與Con組相比，mimic組的成骨細胞分化能力顯著降低(P＜0.01)；而在轉(zhuǎn)染pEX-SIRT1后，細胞中SIRT1、Runx2、Osx、ALP mRNA水平顯著升高，且SIRT1、Runx2、Osx蛋白水平也明顯升高(P＜0.01)；ALP染色檢測得到了相同的結(jié)果(圖3)。轉(zhuǎn)染pEX-SIRT1后明顯改善miR-138-5p mimic導致的MC3T3-E1細胞分化抑制，提示pEX-SIRT1能夠部分抵消成骨細胞分化抑制，且m iR-138-5p依賴SIRT1負調(diào)控成骨細胞分化。

圖3 miR-138-5p依賴SIRT1負調(diào)控成骨細胞分化(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：miR-138-5p mimic和pEX-SIRT1或其陰性對照共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細胞后Runx2、Osx及ALP的mRNA的表達；B：miR-138-5p mimic和pEX-SIRT1或其陰性對照共轉(zhuǎn)染后，Runx2和Osx蛋白的表達；C：ALP染色Fig.3 SIRT1 is essential for miR-138-5p to inhibit osteoblast differentiation (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con group)A: mRNA expression levels of Runx2, Osx and ALP after transfection with mimic-138-5p and pEX-SIRT1 or negative control; B: Protein expression levels of SIRT1, Runx2 and Osx after transfection with mimic-138-5p and pEX-SIRT1 or negative control; C: Representative staining images of ALP in osteoblasts

4 抑 制miR-138-5p可 緩 解 模 擬 失 重 導 致的MC3T3-E1細胞分化抑制 為了進一步探究模擬失重下通過miR-138-5p/SIRT1是否調(diào)節(jié)成骨細胞的分化，我們用miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞12 h后在模擬失重環(huán)境中培養(yǎng)48 h。與Con組相比，抑制miR-138-5p可以部分緩解模擬失重導致的SIRT1 mRNA和蛋白表達抑制以及成骨分化抑制，表現(xiàn)為促進SIRT1、Runx2、Osx、ALP mRNA表達，促進SIRT1、Runx2、Osx蛋白表達(P＜0.01)(圖4)。提示通過抑制miR-138-5p/SIRT1通路可以減輕模擬失重下成骨細胞的分化抑制，miR-138-5p可以作為潛在的干預靶點。

圖4 抑制miR-138-5p可緩解模擬失重導致的MC3T3-E1細胞分化抑制(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：轉(zhuǎn)染miR-138-5p inhibitor后模擬失重48 h，SIRT1、Runx2、Osx及ALP的mRNA表達；B：轉(zhuǎn)染miR-138-5p inhibitor后模擬失重48 h，SIRT1、Runx2和Osx的蛋白表達Fig.4 Silencing miR-138-5p could alleviate the alterations in differentiation of MC3T3-E1 cells under simulated microgravity conditions (aP ＜0.05, bP ＜ 0.01, vs Con group)A: mRNA expression levels of SIRT1, Runx2, Osx and ALP after transfection with miR-138-5p inhibitor by qRT-PCR under microgravity; B: Protein expression levels of SIRT1, Runx2 and Osx after transfection with miR-138-5p inhibitor by Western blotting under microgravity

討 論

骨骼是一種動態(tài)組織，成骨細胞的合成代謝和破骨細胞的分解代謝使骨骼組織不斷自我更新，并保持適當?shù)墓橇亢外}穩(wěn)態(tài)[17]。機械刺激在維持骨骼重塑方面起著重要作用。同時，骨骼可以通過調(diào)整自身的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)來應(yīng)對力學條件的變化[1]。失重引起的骨骼系統(tǒng)損傷是中長期航天飛行的主要局限之一。在航天員和地面動物模型中，已經(jīng)證實失重可造成骨量減少、礦化減少和骨基質(zhì)基因表達降低[18-19]。

SIRT1是基因表達、細胞分化和代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。動物實驗表明過表達SIRT1可延長小鼠的壽命，并可緩解衰老所致的骨質(zhì)疏松[20]。SIRT1敲除的小鼠小梁骨和骨皮質(zhì)中均出現(xiàn)明顯的缺陷，并隨著年齡增長不斷惡化，表明SIRT1在骨骼重塑中至關(guān)重要[21]。SIRT1可通過抑制PPARγ或激活β-catenin、FoxO和Runx2表達促進成骨細胞分化[22-24]，但SIRT1是否在失重環(huán)境下參與骨骼發(fā)育及其上游調(diào)控機制尚不清楚。越來越多的證據(jù)顯示miRNA參與多種骨骼疾病的預后和進展，并可能成為未來基因治療的靶點[10-12]。miR-138-5p是一種機械敏感的miRNA，在機體發(fā)育中起著復雜而全面的調(diào)節(jié)作用。miR-138作為腫瘤抑制因子，可參與腫瘤細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移、細胞周期的調(diào)節(jié)，以及DNA損傷反應(yīng)和修復[25]。此外，miR-138在神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)疾病、心臟形態(tài)發(fā)生和乳腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用[26]。最近研究表明miR-138是骨骼細胞的關(guān)鍵調(diào)控因子，在骨骼疾病中發(fā)揮重要作用，如骨質(zhì)疏松、骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨關(guān)節(jié)炎和軟骨肉瘤等[27]。SIRT1最近被確定為miR-138的靶基因，可能與神經(jīng)發(fā)育和疾病有關(guān)[28]。然而目前尚未報道模擬失重下能否通過miR-138-5p/SIRT1通路調(diào)控成骨細胞分化。

本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1細胞在模擬失重環(huán)境中SIRT1表達降低，而miR-138-5p表達水平顯著升高。分別向細胞中轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic或inhibitor進行功能實驗，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p能夠顯著減少Runx2、Osx mRNA及蛋白表達；miR-138-5p inhibitor能夠上調(diào)Runx2、Osx蛋白水平，但對Runx2、Osx、ALP mRNA水平無影響，表明miR-138-5p inhibitor可能通過抑制mRNA的翻譯對SIRT1進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而非調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，進而促進成骨細胞分化。此外，抑制miR-138-5p可以緩解模擬失重導致的MC3T3-E1細胞分化抑制。綜上，miR-138-5p通過直接靶向SIRT1抑制成骨細胞分化，可能對失重引起的骨質(zhì)丟失具有保護作用。本研究揭示了miR-138-5p/SIRT1信號通路在成骨細胞中的功能，為以miR-138-5p為干預靶點治療失重性骨質(zhì)丟失或廢用性骨質(zhì)疏松癥提供了實驗依據(jù)。