蔣 迪，王仙仁，林正權(quán)，黃妙銘，毛志強，徐志鴻，何錦添，傅 明南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣東東莞 53000；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻喉科，廣東廣州 50000

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是一種常見的鼻腔鼻竇黏膜炎癥，多中心流行病學(xué)調(diào)查顯示我國CRS的總患病率為8.0%(4.8% ～9.7%)[1]。CRS的病理學(xué)特點表現(xiàn)為鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥，根據(jù)炎癥程度的不同包括從黏膜增厚到息肉形成的不同階段[2]。其主要病理學(xué)變化為反復(fù)的黏膜上皮損傷、基底膜增厚、腺體增生、細(xì)胞外基質(zhì)改變及炎癥細(xì)胞浸潤。臨床上常分為慢性鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition state，EMT)是上皮組織重塑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，在CRS的發(fā)病中有重要作用，但其具體機制尚未闡明[3-4]。Sirtuin是Ⅲ類組蛋白去乙?；福哂袕V泛的作用底物，可以調(diào)節(jié)能量代謝平衡、細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、基因組穩(wěn)定性和衰老等多種病理生理過程，其家族成員(Sirtuin 1~7)在多種疾病的EMT過程中也扮演著重要角色[5-9]。Sirtuin 1(SIRT1)作為最早在人體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的Sirtuin蛋白家族中的一員，近年來在下呼吸氣道炎癥性疾病、肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病的研究中備受關(guān)注[10-11]。然而，Sirtuin 1對鼻黏膜上皮EMT的調(diào)控作用則報道較少。本研究利用免疫組織化學(xué)染色、Realtime PCR、Western blot檢測CRSsNP上皮細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，并應(yīng)用細(xì)胞學(xué)實驗探討其對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)鼻黏膜EMT的影響。

材料與方法

1 標(biāo)本收集 2019年9月- 2020年5月在東莞市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科進(jìn)行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的CRSsNP患者共20例。診斷基于患者的臨床病史、前鼻鏡檢查、鼻內(nèi)窺鏡檢查及鼻旁竇CT檢查，符合歐洲鼻-鼻竇炎和鼻息肉臨床指南(EPOS 2020)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。其中男12例，女8例，年齡13 ～70歲，平均45.9歲；另收集同期在東莞市人民醫(yī)院因除慢性鼻竇炎之外的疾病而行鼻內(nèi)鏡手術(shù)患者的中鼻道篩竇黏膜組織標(biāo)本15例作為對照組，CT提示對照組所有個體均無鼻竇炎性疾病。其中男8例，女7例，年齡19 ～45歲，平均34.7歲。CRSsNP黏膜上皮取自病變篩竇黏膜組織，樣本收集后立即以4%多聚甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋。對照組及CRSsNP患者排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前1個月內(nèi)接受抗生素、糖皮質(zhì)激素及抗組胺藥物治療；單側(cè)后鼻孔息肉、真菌性鼻-鼻竇炎、變應(yīng)性鼻炎、哮喘、囊性纖維化、糖尿病、艾滋病、免疫系統(tǒng)性疾病等免疫系統(tǒng)功能不全；該研究在東莞市人民醫(yī)院倫理委員會的同意和監(jiān)督下開展(倫理注冊號：KYKT2018-039)，并與患者及家屬簽署知情同意書 ，獲得患者及家屬的知情同意。

2 主要試劑與設(shè)備 SIRT1、E-cadherin、Ncadherin、α-SMA、Vimentin、TGF-β1和GAPDH引物購于上海生工生物有限公司；SIRT1 (ab189494)、E-cadherin (ab1416)、α-SMA (ab5694)、Vimentin(ab8978)、N-cadherin (ab18203)、GAPDH (ab9485)抗體購于英國Abcam公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購于瑞士ROCHE公司；SYBR green染料購于美國Thermo公司；總蛋白提取試劑RIPA購于美國Invitrogen公司。石蠟切片機和烤片機(德國LEICA公司)；抗原修復(fù)鍋(北京海德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；正置顯微鏡(日本Olympus公司)；-80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)；實時定量PCR儀(美國ABI7500)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)；Western blot電泳儀、電轉(zhuǎn)槽(美國Bio-Rad公司)；恒溫水浴箱(上海博迅醫(yī)療 生物儀器有限公司)。

3 RNA提取及RT-PCR Trizol裂解液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒制備cDNA。通過ABI7500實時熒光定量PCR儀檢測各組樣本，以GAPDH為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)檢測3次，用ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。以生物信息學(xué)軟件GenBank檢索相關(guān)基因序列，采用 Primer 5軟件設(shè)計引物，具體序列見表1。

表1 目的基因引物序列Tab. 1 Primers used for reverse transcription-quantitative PCR

4 免疫組織化學(xué)染色 組織標(biāo)本在4%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，蠟塊切片(4 μm)后步驟如下：切片脫蠟，抗原修復(fù)，清除過氧化物，一抗(E-cadherin及N-cadherin、α-SMA、Vimentin)孵育過夜后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG孵育(中杉金橋PV9000)，DAB顯影，Mayer蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察，免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞膜染成棕黃色為陽性表達(dá)。200倍視野下隨機選取5處視野進(jìn)行觀測。結(jié)果判定：以胞質(zhì)棕色顆粒狀染色為陽性細(xì)胞，在光鏡下(200×)選取5個視野，對陽性細(xì)胞的染色強度進(jìn)行半定量評價，分為4個等級。1級：陰性，細(xì)胞無表達(dá)，0分；2級：細(xì)胞表達(dá)陽性弱，1分；3級：細(xì)胞表達(dá)陽性中等，2分；4級：細(xì)胞表達(dá)陽 性強，3分。

5 Western blot檢測 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，取20 μg蛋白進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉后分別加入E-cadherin及N-cadherin、α-SMA、Vimentin、GAPDH一抗(除GAPDH稀釋比例為1∶100 000，其他一抗稀釋比例均為1∶1 000)，4℃孵育過夜后加入二抗Anti-mouse/rabbit IgG，HRP-linked Antibody(Cell Signaling，1∶2 000)，ECL化學(xué)發(fā)光法(美國Thermo公司)敷膜，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，采集圖像，實 驗重復(fù)3次。

6 人鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和EMT誘導(dǎo) 取單純鼻中隔偏曲患者偏曲對側(cè)鼻腔的下鼻甲鼻黏膜組織，用無鈣鎂離心磷酸鹽緩沖液清洗3次，后置于DMEM/F12培養(yǎng)液，加入0.1%膠原蛋白酶ⅩⅣ中4℃消化12 ～24 h。用10% FCS終止消化。細(xì)胞經(jīng)清洗、離心后，置于塑料培養(yǎng)瓶中，37℃靜置1 h，去除成纖維細(xì)胞。收集懸浮細(xì)胞，以105/孔的細(xì)胞密度置于膜孔徑0.4 μm、生長面積0.33 cm2的Transwell中，在37℃、21%O2、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用BEGM，隔天換液。待細(xì)胞融合，去除Transwell上室培養(yǎng)液，采用氣液界法繼續(xù)培養(yǎng)。為誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞EMT，向培養(yǎng)基中加入50 ng/mL TGF-β1(由上海生工合成)，誘導(dǎo)24 h、48 h和72 h后觀察鼻黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamin 2000，按說明書分別將1 μg SIRT1和pcDNA(3.1+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至鼻黏膜上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后更新培 養(yǎng)基。

7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。Kruskal-Wallis檢驗分析數(shù)據(jù)正態(tài)分布。兩組間比較采用Student t檢驗。三組比較采用One-way ANOVA，Bonferroni post hoc test分析組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。

結(jié) 果

1 SIRT1在CRSsNP黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)減少 從細(xì)胞形態(tài)判斷，SIRT1主要表達(dá)于正常鼻黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕色顆粒狀染色(圖1A)。黏膜下層中漿液腺腺體陽性強度增強，部分黏液腺腺體陽性(圖1B)。而CRSsNP鼻黏膜上皮的SIRT1表達(dá)明顯較正常鼻黏膜上皮減少。CRSsNP上皮層表達(dá)SIRT1陽性評分(1.25±0.55)明顯低于正常對照組(2.6±0.51，P＜0.001)。但CRSsNP組與正常對照組在局部腺體表達(dá)SIRT1的陽性評分差異無統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(2.05±0.39 vs 2.27±0.46，P＞0.05)。Western blot結(jié)果顯示CRSsNP組SIRT1蛋白水平明 顯低于正常鼻黏膜組織(P＜0.001)。見圖2。

圖1 高倍鏡(200×)下免疫組化檢測SIRT1在CRSsNP和對照組篩竇黏膜中的表達(dá)。正常鼻黏膜上皮和固有層腺體SIRT1表達(dá)均為強陽性；CRSsNP黏膜上皮SIRT1表達(dá)為弱陽性，固有層腺體SIRT1表達(dá)為強陽性Fig.1 Control ethmoid sinus mucosa from patients without nasal disease, ethmoid sinus mucosa from patients with CRSsNP were immunostained with SIRT1 antibodies. SIRT1 was strongly positive in mucosa epithelia and glands in lamina propria from control subject. SIRT1 was weakly positive in mucosa epithelia, while strongly positive in glands in lamina propria from patients with CRSsNP

圖2 Western blot檢測正常鼻黏膜組織和CRSsNP中SIRT1蛋白相對表達(dá)量Fig.2 Protein expression levcl of SIRT1 in the controls and CRSsNP subjects using Western blot

2 CRSsNP黏膜上皮細(xì)胞中存在EMT Western blot結(jié)果顯示，上皮標(biāo)志物E-cadherin和Occludin在CRSsNP組織中表達(dá)相較于正常鼻黏膜組顯著減少(P＜0.001)。而CRSsNP黏膜上皮中間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)較對照組顯著增加(P＜0.001)。與對照組相比，CRSsN P黏膜上皮TGF-β1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P＜0 .001)。見圖3。

圖3 正常鼻黏膜組織和CRSsNP中EMT相關(guān)蛋白和TGF-β1 mRNA表達(dá)差異A：Western blot檢測正常鼻黏膜組織和CRSsNP中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況；B：RT-PCR檢測正常鼻黏膜組織和CRSsNP中TGF-β1 mRNA表達(dá)情況Fig.3 Protein expression levels of EMT markers and TGF-β1 mRNA expression in the controls and CRSsNP subjectsA: Protein expression levels of EMT markers in the controls and CRSsNP subjects; B: TGF-β1 mRNA expression in the controls and CRSsNP subjects

3 TGF-β1下調(diào)人鼻黏膜上皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá) 50 ng/mL TGF-β1分別刺激人鼻黏膜上皮細(xì)胞24 h、48 h和72 h，顯微鏡下觀察到隨著TGF-β1刺激時間增加，人鼻黏膜上皮細(xì)胞間隙逐漸增大，72 h后可見腫脹和死亡的細(xì)胞，纖毛數(shù)量也隨著時間推移逐漸減少直至消失(圖4)。同時我們檢測人鼻黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，TGF-β1刺激24 h、48 h、72 h后人鼻黏膜上皮細(xì)胞中SIRT1 mRNA表達(dá)均明顯下降(P＜0.001)(圖5A)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1蛋白的下降趨勢呈現(xiàn)時間依賴性，即TGF-β1刺激24 h、48 h、72 h后人鼻黏膜上皮細(xì)胞中 SIRT1蛋白表達(dá)逐漸下降(P＜0.001)。見圖5B。

圖4 TGF-β1刺激人鼻黏膜上皮細(xì)胞24 h、48 h和72 h后形態(tài)變化(白色箭頭為纖毛，高倍鏡200×)Fig.4 Morphological changes in TGF-β1 induced human NECs(white arrow: cilia, magnification 200×)

圖5 TGF-β1下調(diào)人鼻黏膜上皮細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，SIRT1蛋白的下降趨勢呈現(xiàn)時間依賴性A：RT-PCR檢測TGF-β1分別刺激人鼻黏膜上皮細(xì)胞24 h、48 h、72 h后SIRT1 mRNA表達(dá)情況；B：Western blot檢測TGF-β1分別刺激人鼻黏膜上皮細(xì)胞24 h、48 h、72 h后SIRT1蛋白表達(dá)情況Fig.5 TGF-β1 downregulated the mRNA and protein expression level of SIRT1 in human NECs in a time-dependent manner A: SIRT1 mRNA expression in the human NECs cultured by treatment with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h; B: SIRT1 protein expression in the human NECs cultured by treatment with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h

4 過表達(dá)SIRT1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞EMT Western blot實驗的結(jié)果顯示50 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)48 h后人鼻黏膜上皮細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin明顯減少，而間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。過表達(dá)SIRT1可以顯著上調(diào)E-cadherin表達(dá)，降低α-SMA、Vimentin和N-cadherin表達(dá)，表明S IRT1對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT起抑制作用。見圖6。

圖6 SIRT1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化Fig.6 SIRT1 suppressed EMT induced by TGF-β1 in human NECs

討 論

上皮組織重塑在CRS的發(fā)病過程中有重要作用，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞改變、基底膜增厚、黏膜下組織水腫和纖維增生[13]。而EMT在其中的作用受到越來越多的關(guān)注[3,14]。EMT是指上皮細(xì)胞在正常生理條件和特定病理條件下發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。其起始過程需要外環(huán)境中合適的信號介導(dǎo)，TGF-β1在EMT過程中至關(guān)重要，其可以誘發(fā)呼吸道上皮發(fā)生EMT從而參與下氣道炎性疾病的發(fā)生發(fā)展[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)CRSwNP、CRSsNP黏膜組織中TGF-β1表達(dá)均出現(xiàn)明顯升高[17-18]，TGF-β1可以通過Smad經(jīng)典通路和非Smad通路誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[3,19-20]，本研究中CRSsNP黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)生EMT，同時TGF-β1表達(dá)增加，TGF-β1可以誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，這與既往報道一致。

研究顯示TGF-β1誘導(dǎo)EMT與SIRT1密切相關(guān)，TGF-β1可以調(diào)節(jié)組織細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)水平，而調(diào)控SIRT1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程，從而影響多種細(xì)胞生物學(xué)行為[21-24]。本研究中，CRSsNP黏膜上皮中SIRT1表達(dá)減少，提示SIRT1可能在CRSsNP的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。SIRT1調(diào)控EMT具有正負(fù)雙重機制。正性調(diào)控機制可能為SIRT1作用于MBD1、Twist和Zeb1等基因，減弱E-cadherin啟動子活性從而降低E-cadherin的表達(dá)，可以促進(jìn)胰腺炎、前列腺癌、胰腺癌等上皮細(xì)胞EMT。負(fù)性保護(hù)機制可能為SIRT1通過去乙?；疭mad4抑制TGF-β1/Smad信號通路，繼而抑制MMP7的轉(zhuǎn)錄和E-cadherin的降解，從而抑制口腔鱗癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤和心、肝、肺、腎等器官上皮細(xì)胞EMT[9]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1下調(diào)人鼻黏膜上皮細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)，同時促進(jìn)EMT，過表達(dá)SIRT1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人鼻上皮細(xì)胞EMT，說明SIRT1對人鼻黏膜上皮細(xì)胞的EMT可能有負(fù)性保護(hù)作用。Lee等[5]發(fā)現(xiàn)SIRT1在CRSsNP中增加，而在CRSwNP中減少，細(xì)胞和動物實驗揭示SIRT1可能通過下調(diào)HIF-1α的活性抑制EMT，在鼻息肉的形成中起拮抗保護(hù)作用。Yang等[25]則報道CRSwNP、CRSsNP黏膜上皮中均出現(xiàn)SIRT1下調(diào)，在CRSwNP中表達(dá)的尤為明顯，miR-155靶向抑制SIRT1從而拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞EMT。這些報道與我們的研究是相互驗證的。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果初步證實SIRT1在CRSsNP的黏膜上皮細(xì)胞中低表達(dá)，其對TGFβ1誘導(dǎo)的人鼻黏膜細(xì)胞EMT起抑制作用，提示SIRT1可能參與CRSsNP發(fā)生發(fā)展的病理生理過程。但SIRT1的具體作用機制及調(diào)控靶點還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。