李 晨，李 鑫，劉春蕾，楊明會解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 0085；解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 中醫(yī)科，北京 0085；解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，北京 0085

缺氧性肺高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是由于暴露于低壓缺氧環(huán)境中而引起的平均肺動脈壓力(mean pulmonary artery pressure，mPAP)≥30 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)的一種生存率極低的慢性進展性疾病[1]，屬于肺性高血壓(pulmonary hypertension，PH)的第三種類型[2]。世界上大約有1.4億居民永久生活在海拔高于2 500 m的環(huán)境中，每年超過4 000萬的游客去往高原地區(qū)，這些人群均有可能發(fā)展為HPH[3]，成為世界重大公共衛(wèi)生問題，臨床上沒有特定的治療HPH的有效療法，因此尋找可靠有效的靶點藥物是臨床研究的重點。治療PH的藥物主要靶向縮血管分子或擴血管分子，代表藥物包括馬西替坦(Macitentan)、賽樂西帕(Selexipag)和維利西呱(Vericiguat)。內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)作為一種對缺氧高度敏感的血管活性分子[4]，其激活導(dǎo)致肺血管收縮和平滑肌細胞增殖，馬西替坦作為ET-1拮抗劑，可顯著降低PH患者的發(fā)病率和死亡率[5]。PH患者內(nèi)皮一氧化氮(NO)生成顯著減少，NO作為一種關(guān)鍵血管擴張劑，可通過激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，最終促進小動脈的血管舒張，抑制細胞增殖。維利西呱作為sGC刺激劑，可在不依賴NO的情況下促進血管重塑和舒張[6]。目前單一藥物治療PH往往效果不佳，多靶點藥物聯(lián)合是未來抗PH藥物研究的重要方向，本課題組既往曾報道馬西替坦用于治療HPH的作用[7]，而目前尚缺乏藥物聯(lián)合治療HPH的報道，鑒于此，本研究探討馬西替坦聯(lián)用維利西呱治療HPH的作用機制，為進一步研發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(220±20) g，購自維通利華實驗動物有限公司，所有動物實驗程序均通過解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會(IACUC)批準(2017-X13-05)。動物置于動物飼養(yǎng)籠，隨后置入低壓氧實驗動物倉中，保持室 內(nèi)溫度18℃~22℃。

2 藥品、試劑和主要儀器 馬西替坦、維利西呱(上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司；0.9%氯化鈉注射液溶解)； 戊巴比妥鈉(Sigma，美國)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)，EDTA抗原修復(fù)液、BSA封閉液(Thermo Fisher)；二甲苯、中性樹膠(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，HE染色試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)；蛋白酶和磷酸酶抑制劑、RIPA裂解緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所)。小動物低壓氧艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司)；小動物超聲(Visualsonic，加拿大)；小動物呼吸機(Kent Scientific，美國)；多導(dǎo)生理信號采集處理系統(tǒng)、壓力容積導(dǎo)管(AD Instruments，美國)；正置熒光顯微鏡(Nikon，日本)；高通量掃描電子顯微鏡(北京聚束科技有限公司)；掃描儀( Innopsys，法國)。

3 分組及給藥 60只健康雄性SD大鼠隨機分為5組：空白組、模型組、Macitentan組(10 mg/kg)、Vericiguat組(10 mg/kg)、Maci&Veri組(10 mg/kg+10 mg/kg)，每組12只?？瞻捉M常氧飼養(yǎng)，其余各組在同一環(huán)境下低氧艙中飼養(yǎng)2周，氧濃度為10%，二氧化碳濃度為2%，模擬5 500 m高原環(huán)境。造模結(jié)束后各組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，1次/d，連續(xù)2周，空白組和模型組進行等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，飼養(yǎng)過程保持12 h的明暗交替，墊 料每周更換2次。

4 肺血流及右心功能檢測 給藥結(jié)束后，將大鼠在無菌條件下應(yīng)用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)給予腹腔麻醉，脫毛后將大鼠固定于操作臺上，運用小動物超聲30 MHz探頭獲取右心長軸、短軸以及四腔心切面，分別測量并記錄肺加速時間/肺射血時間(pulmonary blood flow acceleration time/pulmonary ejection time，PAT/PET)、右心室縮短率(right ventricular fractional shortening，RVFS)、右心室射血分數(shù)(right ventricular ejection fraction，R VEF)。

5 肺動脈壓力測定 超聲心動圖測量完成后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)平臺上，逐層切開頸部皮膚后行氣管插管接小動物呼吸機。于胸骨左緣第4肋間切開，暴露肺和心臟，用無菌濕棉球墊壓左肺，鑷子撕開心包充分暴露心臟，用1 mL注射器針頭在右心室流出道處扎一個小孔，沿小孔送入壓力-容積導(dǎo)管測壓，并向前延伸順勢進入肺動脈測壓。采用多導(dǎo)生理信號采集處理系統(tǒng)測量壓力，分別記錄并計算出平均肺動脈壓力(mean p ulmonary artery pressure，mPAP)。

6 右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)測量 血流動力學(xué)檢測完成后，處死大鼠，取下心臟，去除心耳和心房，準確裁剪并稱量右心室、左心室、室間隔的重量，計算R VHI。RVHI=RV/(LV+IVS)。

7 肺小血管免疫熒光觀察 將肺組織切片二甲苯脫蠟，各級乙醇脫水后置于EDTA抗原修復(fù)液中。PBS脫色，甩干后滴加5% BSA封閉30 min，加入一定濃度的一抗：α-平滑肌肌動蛋白、增殖細胞核抗原濕盒內(nèi)4℃過夜。PBS脫色后滴加二抗避光室溫孵育60 min，PBS脫色洗滌后甩干、封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，中膜厚度百分比(WT%) = (外彈力膜直徑-內(nèi)彈力膜直徑 )/外彈力膜直徑×100%。

8 心肌組織病理檢測 將右心組織放入4%多聚甲醛中固定、包埋，用于觀察。心肌纖維化：HE染色將心臟組織切片二甲苯脫蠟，各級乙醇脫水后蘇木素染色，1%鹽酸-乙醇分化液分化，1%稀氨水促藍液返藍，沖洗后0.5%伊紅液染色，各級乙醇脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封固。心肌細胞超微結(jié)構(gòu)：心臟組織切片用1%四氧化鋨在4 ℃條件下固定2 h，用二甲砷酸鈉洗滌液清洗2次，各級乙醇脫水后用純乙醇和醋酸正戊酯混合液置換，純醋酸正戊酯置換3次，在干燥儀中干燥2 h后固定于樣品臺上，放入離子濺射儀中 噴金3 min，用掃描電鏡觀察并照相記錄。

9 蛋白芯片檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、Rho卷曲蛋白激酶 2(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2)、過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPAR-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解大鼠右心組織，使用基于生物素標記的定制抗體陣列對樣品進行分析。即對每個樣品中的30 μg總蛋白進行生物素化處理，然后添加到預(yù)先用捕獲抗體預(yù)印的重復(fù)玻片上，將結(jié)合的蛋白與鏈霉親和素綴合的熒光染料一起孵育，在532 nm的激發(fā)波長下掃描陣列，并 使用InnoScan300微陣列掃描儀測量熒光。

10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以±s 表示，組間差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較用L SD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠mPAP、RVHI、右心室功能指標比較 與空白組大鼠相比，模型組大鼠的mPAP和RVHI顯著升高，RVEF、RVFS、PAT/PET顯著下降(P＜0.01)；與模型組比較，馬西替坦組mPAP和RVHI降低(P＜0.01)，RVEF、RVFS、PAT/PET升高(P＜0.05)；維利西呱組mPAP和 RVHI有降低趨勢(P＞0.05)，RVEF、RVFS、PAT/PET升高(P＜0.05)；聯(lián)合用藥組mPAP、RVHI降低，RVEF、RVFS、PAT/PET升高(P＜0.01)；與馬西替坦和維利西呱單獨用藥組比較，聯(lián)合用藥組mPAP和RVHI顯著降低，RVEF、RVFS、PAT/P ET明顯升高(P＜0.05)(表1)。

表1 各組大鼠平均肺動脈壓、右心室肥厚指數(shù)、右心功能指標比較(n=5)Tab. 1 Comparison of mPAP, RVHI, and right ventricular function indexes of rats in each group (n=5)

2 各組大鼠肺小血管免疫熒光觀察 與空白組相比，模型組大鼠的肺小動脈血管壁逐漸增厚，管腔逐漸狹窄，WT%值(P＜0.001)增加；與模型組相比，馬西替坦組血管壁厚度、WT%值(P=0.057)降低，維利西呱組血管壁厚度、WT%值有降低的趨勢但無統(tǒng)計學(xué)差異，聯(lián)合用藥組血管壁厚度、WT%值(P=0.002)明顯降低；與馬西替坦和維利西呱單獨用藥組比較，聯(lián)合用藥組WT%值(P=0.048、0.000 7)均顯著降低(圖1)。

圖1 各組大鼠肺小血管病理學(xué)改變(免疫熒光，400×)和WT%比較免疫熒光染色用于標記肺小血管中PCNA(紅色)和α-SMA(綠色)的表達，細胞核用DAPI染色(藍色)。aP ＜0.05，vs空白組；bP ＜0.05，vs模型組；cP ＜0.05，vs Maci&Veri組Fig.1 Pathological changes of pulmonary small vessels of rats in each group (IF, 400×) and comparison of WT%Immunofluorescence staining of small pulmonary blood vessels is used to mark the expression of PCNA (red) and α-SMA (green), and the nucleus is stained with DAPI (blue);Comparison of WT% of rats in each group (aP ＜0.05, vs control; bP ＜0.05, vs vehicle; cP ＜0.05, vs Maci&Veri)

3 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)改變 空白組大鼠心肌細胞正常，模型組大鼠心肌細胞排列紊亂且心肌細胞肥大，用藥后各組大鼠心肌組織損傷改善，聯(lián)合用藥組心肌組織損傷改善最明顯(圖2)?？瞻捉M大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠心肌細胞中線粒體排列紊亂、固縮色加深，用藥后心肌細胞損傷減輕，聯(lián)合用藥組心肌組織損傷減 輕程度最明顯(圖3)。

圖2 各組大鼠心肌組織纖維化病理學(xué)改變(HE染色，400×)Fig.2 Pathological changes of myocardial fibrosis of rats in each group (HE staining, 400×)

圖3 各組大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)改變(掃描電鏡，10 000×)Fig.3 Cardiomyocytes ultrastructural changes of rats in each group (SEM, 10 000×)

4 各組大鼠右心組織相關(guān)蛋白表達水平比較 與空白組相比，模型組iNOS(P=0.031)、ROCK2(P=0.019)表達增加，SOD(P＜0.001)、BMP2(P＜0.001)、PPAR-α(P＜0.001)表達降低。與模型組比較，馬西替坦組iNOS(P=0.018)、SOD(P=0.000 3)、BMP2(P＜0.001)、PPAR-α(P=0.001)表達升高，ROCK2(P=0.048)表達降低；維利西呱組PPAR-α(P=0.006)表達升高，iNOS、SOD、BMP2、ROCK2表達無統(tǒng)計學(xué)差異；聯(lián)合用藥組iNOS(P=0.016)、SOD(P＜0.001)、BMP2(P＜0.001)、PPAR-α(P＜0.001)表達進一步增加，ROCK2(P=0.039)表達降低。與馬西替坦單獨給藥組比較，聯(lián)合用藥組BMP2(P=0.016)表達明顯升高；與維利西呱單獨給藥組比較，聯(lián)合用藥組iNOS(P=0.011)、PPAR-α(P=0.016)、BMP2(P=0.016)表達顯著升高，ROCK2( P=0.028)表達降低(圖4)。

圖4 各組大鼠右心組織iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α、ROCK2的表達水平 (aP ＜0.05，vs空白組；bP ＜0.05，vs模型組；cP ＜0.05，vs Maci&Veri組)Fig.4 Expression of iNOS, SOD, BMP2, ROCK2, PPAR-α protein in right ventricle tissues of rats in each group (aP ＜0.05, vs control; bP ＜0.05,vs vehicle; cP ＜0.05, vs Maci&Veri)

討 論

缺氧刺激引起肺血管收縮和阻力增加，持續(xù)缺氧還會引起肺小動脈和靜脈水平的血管重塑，以及成纖維細胞和平滑肌細胞的增殖，導(dǎo)致不可逆的肺血管增厚狹窄，這些基礎(chǔ)病理改變在肺動脈壓力持續(xù)升高過程中發(fā)揮著重要作用。馬西替坦作為治療PH的有效藥物，具有較高的組織滲透性和較低的肝毒性風(fēng)險[8]，臨床報道維利西呱作為sGC刺激劑可增加內(nèi)源性NO的敏感度，刺激環(huán)狀鳥苷單磷酸的產(chǎn)生，促進血管舒張，從而降低患者的心血管風(fēng)險[9]。單一靶向藥物的治療多通過舒血管作用維持正常血流供應(yīng)緩解病情進展，而其源頭內(nèi)皮功能障礙和其終點右心衰竭均未得到有效改善，成為抗PH藥物在臨床應(yīng)用中受限的重要原因[10]。據(jù)報道多靶點藥物聯(lián)合與單藥治療相比，可通過協(xié)同作用提高療效，降低臨床惡化率，成為未來的治療方向[11]。本研究通過構(gòu)建HPH大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血流動力學(xué)異常、右心肥厚，右心功能指標如RVEF、RVFS、PAT/PET明顯降低，伴有肺小血管壁增厚、心肌損傷等癥狀，顯示HPH大鼠模型構(gòu)建成功。

本實驗顯示，馬西替坦組可有效緩解缺氧引起的mPAP、RVHI升高以及右心室功能損傷。維利西呱組對mPAP、RVHI升高的影響不大，但可有效降低缺氧引起的右心室功能改變，維利西呱的治療作用以左心疾病引起的PH為主，其是否適用于其他類型的PH仍有待研究[6]。雖然維利西呱在單獨使用時治療效果不佳，但聯(lián)合用藥后可明顯降低肺動脈壓力并改善右心功能，且效果優(yōu)于馬西替坦組。病理檢測結(jié)果也顯示聯(lián)合用藥后可明顯抑制心肌肥厚、肺小血管重構(gòu)及心肌線粒體損傷，效果優(yōu)于馬西替坦、維利西呱單獨給藥組，以上均表明了馬西替坦與維利西呱聯(lián)用具有協(xié)同作用。

NO是體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個氣體信息分子，是細胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與體內(nèi)多個系統(tǒng)的生理和病理過程[12]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO合成的關(guān)鍵酶，其活性變化直接調(diào)節(jié)NO的生成量及其生物學(xué)效應(yīng)，NOS又分為結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型兩種亞型，iNOS在病理條件下由炎癥、腫瘤等誘生[13]。本研究結(jié)果表明，在缺氧環(huán)境中，模型組iNOS合成增加，是機體一種代償性的保護機制。與模型組相比，馬西替坦組iNOS表達量進一步增加，維利西呱組iNOS表達量增加不明顯，聯(lián)合用藥組可進一步增加iNOS表達量。這可能與Macitentan聯(lián)用Vericiguat協(xié)同增加iNOS的表達，導(dǎo)致體內(nèi)NO合成增加相關(guān)。

PPAR-α是調(diào)節(jié)脂肪酸的關(guān)鍵基因，在右心室肥大過程中表達量減少，PPAR-α缺失會引起心肌肥大[14-15]。SOD是反映人體內(nèi)自由基代謝狀態(tài)的重要指標之一，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其水平高低可間接反映機體內(nèi)清除自由基的能力，檢測SOD水平可了解機體損傷情況。心肌缺血缺氧時機體自由基代謝紊亂，SOD水平下降，治療后SOD水平可明顯升高[16-17]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族，其在骨的再生和修復(fù)中起重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)BMP參與調(diào)節(jié)多種細胞增殖、分化和凋亡的生物學(xué)過程。缺氧會引起B(yǎng)MP2表達量下降，即缺氧可抑制BMP2的表達[18]。ROCK具有絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性，是一種與細胞凋亡相關(guān)的結(jié)合蛋白，ROCK2是活化的Caspase3、Casepase2等的裂解產(chǎn)物，與Caspase介導(dǎo)的凋亡相關(guān)[19]。本研究檢測結(jié)果顯示，持續(xù)缺氧引起右心室組織中iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α的表達明顯降低，ROCK2增加。馬西替坦可提高iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α的表達，降低ROCK的表達，維利西呱作用不顯著，聯(lián)合用藥后可進一步增加iNOS、SOD、BMP2、PPAR-α的表達，并降低ROCK2的表達，提示馬西替坦聯(lián)用維利西呱對右心室肥厚的保護作用更佳。

綜上所述，本研究證實馬西替坦聯(lián)用維利西呱具有協(xié)同作用，能更好地發(fā)揮藥物的舒血管作用，可降低肺動脈壓力、減少右心肥厚、改善肺小血管重構(gòu)和心肌損傷，這可能與兩者聯(lián)用能減少體內(nèi)自由基、脂肪酸代謝，并緩解細胞增殖及凋亡等損傷相關(guān)，為今后抗HPH的聯(lián)合藥物應(yīng)用和進一步研究提供重要的依據(jù)和參考。