吳敏蘭，黃春華，陳進(jìn)樹(shù)，王美容，吳錦程, 3

(1.漳州城市職業(yè)學(xué)院 園林園藝系，福建 漳州 363000；2.莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100; 3.枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100)

依據(jù)果肉顏色，枇杷可分為黃肉枇杷和白肉枇杷兩大類(lèi).“白梨”(EriobotryajaponicaLindl. cv. Baili)為白肉枇杷的一個(gè)品種，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富、甜度高、口感好[1]，但“白梨”枇杷果實(shí)偏小，影響其商品價(jià)值.膨大劑(fruit-expander)是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂.在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，使用膨大劑可以促進(jìn)果實(shí)提早成熟、增大果徑、提高產(chǎn)量等.蔣小平等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在獼猴桃上使用膨大劑可增大果實(shí)并提高其市場(chǎng)需求量，但過(guò)度使用膨大劑將導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)與掛果數(shù)的下降.近年來(lái)，膨大劑被應(yīng)用于枇杷生產(chǎn).因白肉枇杷果型普遍小于黃肉枇杷，果農(nóng)期望通過(guò)噴膨大劑以改善白肉枇杷果型小的缺點(diǎn)，但同樣也存在果實(shí)品質(zhì)下降的現(xiàn)象.

有機(jī)酸是形成枇杷果實(shí)品質(zhì)的主要成分，枇杷果實(shí)以蘋(píng)果酸為主要有機(jī)酸，其次還含有檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙酮酸等有機(jī)酸[3-4].果實(shí)有機(jī)酸代謝研究已有不少的相關(guān)報(bào)道.如Notton等[5]對(duì)油梨果實(shí)的研究表明，蘋(píng)果酸的合成途徑主要與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，EC 4.1.1.31)、蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH，EC 1.1.1.37)密切相關(guān)，且蘋(píng)果酸與OAA進(jìn)入TCA循環(huán)生成檸檬酸，王鵬飛等[6]研究發(fā)現(xiàn)NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP- ME，EC 1.1.1.40)、NAD-MDH及PEPC均與蘋(píng)果酸的合成與分解有關(guān).楊瀅瀅等[7]研究“紐荷爾”臍橙果實(shí)提出檸檬酸的合成與PEPC、CS有關(guān).龔榮高等[8]研究顯示，臍橙果實(shí)中檸檬酸的積累與NAD-異檸檬酸脫氫酶(NAD-IDH，EC.1.1.1.41)活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性.文濤等[9]研究認(rèn)為，PEPC和檸檬酸合成酶(CS，EC 4.1.3.7)隨著臍橙果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸增加，加速了合成檸檬酸的進(jìn)程，相反，抑制檸檬酸合酶的活性可達(dá)到降低有機(jī)酸積累的效果.本研究以 “白梨”枇杷為試驗(yàn)材料，分析膨大劑對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸代謝的影響，以期探討膨大劑處理對(duì)枇杷果實(shí)品質(zhì)影響的生理機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以生長(zhǎng)正常、長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致、本砧高接換種的15年生白肉枇杷“白梨”(EriobotryajaponicaLindl. cv. Baili)為試材(福建省莆田市常太鎮(zhèn)枇杷產(chǎn)區(qū)提供)，按枇杷生產(chǎn)進(jìn)行常規(guī)的水肥、病蟲(chóng)害、疏花、疏果等管理.將供試枇杷樹(shù)分為2組，以花后100 d采用0.01‰氯吡脲蘸枇杷幼果為處理組，以H2O處理為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理5株，重復(fù)3次，共15株.自花后100 d起每隔5 d取樣1次，共取5次，取樣后當(dāng)日運(yùn)回福建省枇杷種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，削皮去核后迅速置于裝有液氮的保溫杯中，處理后再用塑封袋分批裝袋并做好標(biāo)記，保存于-80 ℃冰箱中，待測(cè)相關(guān)指標(biāo).

1.2 主要試劑與儀器

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、還原性輔酶Ⅰ(NADH)、異檸檬酸三鈉鹽、Tris堿、還原型谷胱甘肽(GSH)、草酰乙酸(OAA)、5,5′-二硫硝基苯甲酸(DTNB)、蘋(píng)果酸、無(wú)水硫酸錳、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、碳酸氫鉀、氯化鎂、磷酸烯醇式丙酮酸單鉀鹽、乙酰輔酶A、蔗糖、異抗壞血酸、X-100曲拉通等試劑均為分析純.

MDF-U4086S型超低溫冰箱，5415R型Eppendorf冷凍離心機(jī)，上海美譜達(dá)V-1800型可見(jiàn)分光光度計(jì)，Eppendorf移液槍?zhuān)琾HS-25型酸度計(jì)，超純水系統(tǒng)(Sartorius)，SIM-F140制冰機(jī)(SANYO)，超低溫冰箱(SANYO，MDF-U4086S型)等.

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 蘋(píng)果酸、檸檬酸(CA)含量的測(cè)定 稱(chēng)取0.1 g枇杷果肉在1 mL提取液中進(jìn)行冰浴勻漿，經(jīng)4 ℃下11 000gmin-1離心10 min，取上清液(置冰上)參照蘋(píng)果酸、檸檬酸(CA)檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提供的分光光度法測(cè)定枇杷果實(shí)蘋(píng)果酸、檸檬酸的含量.

1.3.2 酶活性的測(cè)定 NADP-IDH、NAD-MDH、NADP-ME、PEPC、CS酶液提取及活性測(cè)定參照郭潤(rùn)姿[10]的方法稍作修改.酶促反應(yīng)體系為3 mL，以反應(yīng)體系不加酶液進(jìn)行調(diào)零，反應(yīng)底物加入后應(yīng)立即混勻并測(cè)定反應(yīng)3 min前后的吸光度差值.酶活性以1 min吸光度變化0.01為一個(gè)活力單位，酶活性以u(píng)min-1g-1表示.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003和SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)并作圖，結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 膨大劑對(duì)枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中蘋(píng)果酸和檸檬酸含量的影響

蘋(píng)果酸和檸檬酸是枇杷果實(shí)主要的有機(jī)酸，因而對(duì)枇杷果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響(圖1～2).

圖1 枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中蘋(píng)果酸含量的變化 圖2 “白梨”枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中檸檬酸含量變化Fig.1 The changes of malic acid content during developoment of loquat fruit Fig.2 Changes of citric acid content during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

由圖1可見(jiàn),在枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,果實(shí)蘋(píng)果酸含量均呈“升-降”的變化規(guī)律,其中在花后100～115 d,果實(shí)蘋(píng)果酸快速積累,并于115 d達(dá)到峰值,經(jīng)膨大劑處理的枇杷果實(shí)蘋(píng)果酸含量略高于對(duì)照;而在花后115～120 d，果實(shí)的蘋(píng)果酸含量急劇下降,并于花后120 d(即果實(shí)成熟期)達(dá)到最低值,經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)蘋(píng)果酸含量低于對(duì)照,但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).由圖2可知,果實(shí)發(fā)育前期開(kāi)始積累檸檬酸,并于花后110 d達(dá)到峰值;隨著果實(shí)發(fā)育趨向成熟,檸檬酸含量呈急劇下降的趨勢(shì).花后100～110 d發(fā)育階段的果實(shí),對(duì)照組與膨大劑處理的果實(shí)檸檬酸含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而在花后110～115 d經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)檸檬酸含量低于對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)果表明,經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)蘋(píng)果酸、檸檬酸低于對(duì)照組,膨大劑處理抑制了枇杷果實(shí)蘋(píng)果酸、檸檬酸的積累.

2.2 膨大劑對(duì)枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中PEPC和CS酶活性的影響

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)為胞質(zhì)酶，催化PEPβ-羧化生成OAA和無(wú)機(jī)磷，OAA在NAD-蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)催化下還原成蘋(píng)果酸，PEPC是果實(shí)蘋(píng)果酸合成的關(guān)鍵酶.從圖3可知，在枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，果實(shí)PEPC的活性呈現(xiàn)“升-降-升”的變化趨勢(shì)，即在花后100～110 d果實(shí)PEPC活性呈快速上升，并于花后110 d時(shí)達(dá)峰值，110～115 d則呈下降趨勢(shì)，115～120 d轉(zhuǎn)而呈上升趨勢(shì).花后105～110 d果實(shí)PEPC酶活性與對(duì)照相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在花后110～120 d則低于對(duì)照，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)果表明，膨大劑處理抑制了果實(shí)PEPC酶活性，減少果實(shí)蘋(píng)果酸含量的積累.

圖3 “白梨”枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中PEPC活性的變化 圖4 “白梨”枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中CS活性的變化Fig.3 Changes of citric acid content during fruit of Eriobotrya japonica Baililindl. cv. Baili Fig.4 Changes of CS activity during fruit developoment developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

檸檬酸合成酶(CS)催化OAA與Ac-CoA縮合為檸檬酸，是果實(shí)檸檬酸合成的關(guān)鍵酶[7].由圖4可知，在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中，CS酶活性呈“降-升-降”的變化趨勢(shì)，經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)CS酶活性低于對(duì)照，其中在100～105 d顯著低于對(duì)照(P<0.01)；在花后105～110 d，經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)CS酶活性雖低于對(duì)照，但差異并不顯著；而在花后110～120 d，經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)CS酶活性低于對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)果表明，膨大劑抑制了果實(shí)CS酶活性，從而阻礙了果肉細(xì)胞檸檬酸的積累.

2.3 膨大劑對(duì)枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中NADP-IDH和NADP-ME酶活性的影響

異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)參與檸檬酸的分解，而NADP-蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)與蘋(píng)果酸的降解有關(guān)，該2種酶在減少果實(shí)有機(jī)酸中起重要作用[11-12].由圖5可知，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，NADP-IDH酶活性表現(xiàn)為“降-升-降”的動(dòng)態(tài)變化;果實(shí)花后100～105 d，NADP-IDH活性呈快速下降;而在花后105～120 d雖呈現(xiàn)“升-降”的變化趨勢(shì)，但變化幅度較為平緩.經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)NADP-IDH酶活性在花后100～105 d高于對(duì)照，而花后105～120 d兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).經(jīng)相關(guān)性分析，NADP-IDH酶活性與檸檬酸含量呈負(fù)相關(guān).可見(jiàn)，膨大劑處理提高了果實(shí)NADP-IDH酶活性，促進(jìn)了檸檬酸的降解，抑制了檸檬酸的積累.

NADP-ME酶活性在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中與NADP-IDH酶呈“降-升-降”相同的變化規(guī)律，總體上呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但兩者活性變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)存在差異.經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)NADP-ME酶活性高于對(duì)照，兩者在花后105～115 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6)，果實(shí)NADP-ME酶活性與蘋(píng)果酸含量呈負(fù)相關(guān).結(jié)果表明，膨大劑處理提高了NADP-ME酶活性，促進(jìn)蘋(píng)果酸的分解，可能是導(dǎo)致果實(shí)蘋(píng)果酸含量較低的原因之一.

圖5 “白梨”枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中NADP-IDH活性變化 圖6 “白梨”枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中NADP-ME活性變化Fig.5 Changes of NADP-IDH activity during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili Fig.6 Changes of NADP-ME activity during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

2.4 膨大劑對(duì)枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中NAD-MDH酶活性的影響

圖7 “白梨”枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中NAD-MDH活性變化Fig.7 Changes of NAD-MDH activity during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

NAD-蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)是細(xì)胞質(zhì)中蘋(píng)果酸合成的重要酶，通過(guò)PEPC產(chǎn)生OAA，在NAD-MDH的催化下轉(zhuǎn)變成蘋(píng)果酸.在發(fā)育過(guò)程中枇杷果實(shí)NAD-MDH活性呈現(xiàn)現(xiàn)“升-降-升”的變化規(guī)律，花后100～105 d呈上升趨勢(shì)，花后105～115 d急劇下降，花后115～120 d即果實(shí)成熟前再次上升(圖7).膨大劑處理的果實(shí)NAD-MDH活性總體上低于對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).經(jīng)相關(guān)性分析，果實(shí)NAD-MDH酶活性與蘋(píng)果酸含量呈正相關(guān).結(jié)果顯示，膨大劑處理抑制了枇杷果實(shí)NAD-MDH酶活性，可能在一定程度上阻礙了蘋(píng)果酸的生成.

3 討論

亞洲人喜歡偏甜的口味，而歐洲人喜歡偏酸的口味，盡管不同人種的口味偏好不同，但酸和糖始終是構(gòu)成食品風(fēng)味品質(zhì)的兩大重要因素，枇杷果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)也不例外.枇杷為蘋(píng)果酸型果實(shí)，蘋(píng)果酸占果實(shí)中有機(jī)酸含量的56%～92%，還含有檸檬酸、酒石酸和順烏頭酸等[4,13].本研究發(fā)現(xiàn)，膨大劑處理阻礙了枇杷果實(shí)蘋(píng)果酸、檸檬酸的積累，使有機(jī)酸含量低于未經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)，果實(shí)有機(jī)酸含量的降低可能是枇杷生產(chǎn)上使用膨大劑導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味變淡的重要原因之一.試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果酸、檸檬酸的積累主要集中在枇杷果實(shí)發(fā)育的前中期，而進(jìn)入果實(shí)發(fā)育后期和成熟期則積累水平降低，這與其他相關(guān)研究結(jié)果相一致[14-15].

PEPC、NAD-MDH和NADP-ME是果實(shí)發(fā)育過(guò)程中蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶，參與調(diào)控果實(shí)蘋(píng)果酸的形成與積累，其中PEPC和NAD-MDH酶是蘋(píng)果酸合成的關(guān)鍵酶，而NADP-ME酶則促進(jìn)蘋(píng)果酸的降解[16-17].王鵬飛等[6]研究發(fā)現(xiàn)歐李果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，蘋(píng)果酸含量的變化與PEPC、NAD-MDH及NADP-ME活性密切相關(guān)，它們與果實(shí)蘋(píng)果酸的合成與分解有關(guān).王小紅等[18]在“蜂糖李”的研究中發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果酸的積累主要發(fā)生在果實(shí)發(fā)育的前中期，PEPC和NAD-MDH酶活性與果實(shí)蘋(píng)果酸積累呈正相關(guān)，其中以PEPC酶起主要作用，而NADP-ME酶活性與蘋(píng)果酸積累則呈負(fù)相關(guān).本研究表明，經(jīng)膨大劑處理的果實(shí)在其發(fā)育后期和成熟期PEPC、NAD- MDH低于對(duì)照，而NADP-ME酶活性卻高于對(duì)照.不難看出，一方面果實(shí)蘋(píng)果酸合成受阻，另一方面果實(shí)蘋(píng)果酸分解被加強(qiáng)，促使果實(shí)蘋(píng)果酸積累的下降.枇杷作為蘋(píng)果酸型果實(shí)，果實(shí)蘋(píng)果酸積累水平的降低可能是施用膨大劑導(dǎo)致風(fēng)味變淡的重要因素. 柑橘類(lèi)果實(shí)為檸檬酸型果實(shí)，有關(guān)果實(shí)檸檬酸代謝的研究在臍橙上有較多的相關(guān)報(bào)道.楊瀅瀅等[7]研究發(fā)現(xiàn)PEPC酶參與了“紐荷爾”臍橙果實(shí)檸檬酸的合成.龔榮高等[8]報(bào)道了臍橙果實(shí)檸檬酸的積累與NADP-IDH酶活性呈負(fù)相關(guān)性.文濤等[9]研究結(jié)果表明，PEPC和CS酶活性的上升則促進(jìn)臍橙果實(shí)檸檬酸的合成，而抑制PEPC和CS酶活性則降低果實(shí)有機(jī)酸的積累.Sadlka等[12]發(fā)現(xiàn)，檸檬果實(shí)發(fā)育早期檸檬酸含量的快速增加與NADP-IDH活性降低以及CS酶活性的上升密切相關(guān).陳美霞等[15]研究表明CS酶活性與杏果實(shí)檸檬酸含量呈正相關(guān).本試驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)膨大劑處理的枇杷果實(shí)PEPC和CS酶活性低于對(duì)照組，NADP-IDH酶活性雖在果實(shí)成熟前均高于對(duì)照組，但差異并不顯著，表明膨大劑對(duì)枇杷果實(shí)PEPC和CS酶活性具有抑制作用，而對(duì)NADP-IDH酶活性具有激活作用但并不明顯.可見(jiàn)，膨大劑處理通過(guò)抑制PEPC和CS酶活性減少了檸檬酸的合成，而NADP-IDH酶活性上升促進(jìn)檸檬酸的降解，但對(duì)果實(shí)檸檬酸含量的積累水平影響較小.因此，膨大劑處理減少了果實(shí)檸檬酸的積累主要通過(guò)抑制PEPC和CS酶活性起調(diào)控作用，而NADP-IDH酶作用不明顯.

4 結(jié)論

膨大劑處理降低了枇杷果實(shí)中PEPC、CS和NAD-MDH酶活性，提高了NAD-MDH、NADP-ME及NADP-IDH酶的活性，抑制了PEPC、CS和NAD-MDH等蘋(píng)果酸和檸檬酸合成相關(guān)酶的活性，促進(jìn)了NAD-MDH、NADP-ME及NADP-IDH等蘋(píng)果酸和檸檬酸降解相關(guān)酶的活性，可能是膨大劑處理導(dǎo)致果實(shí)蘋(píng)果酸和檸檬酸含量降低的原因.另一方面，可溶性固形物也是構(gòu)成枇杷果實(shí)品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一.蘋(píng)果酸和檸檬酸含量的降低是否是膨大劑處理導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)下降的主要原因有待進(jìn)一步研究.