呂鳳嬌，蔡菊虹，陳西林，吳幼蘭

(泉州師范學院 化工與材料學院，福建 泉州 362000)

黃芩苷是唇形科植物黃芩的干燥根莖中提取分離出的一種黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[1-5]，但黃芩苷親水性較差，生物利用度低，限制了其臨床應用[6].納米粒為固態(tài)膠體，粒徑在10～100 nm，藥物可以溶解、包裹于高分子材料形成載體納米粒[7].納米粒可控制藥物的釋放，有較長的體內循環(huán)時間，可減少藥物被網(wǎng)狀內皮吞噬系統(tǒng)吞噬，從而增加療效[8-9].納米藥物更具一些獨特的性質，比如藥物溶解速率加快，藥物穿透能力增加，藥效穩(wěn)定，藥物體內釋放可控，難溶性藥物的口服吸收改善等[10-12].本研究應用透析法研究黃芩苷殼寡糖納米粒的體外釋放，探究黃芩苷殼寡糖納米粒的緩釋特性，采用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程、雙相動力學方程、Ritger-Peppas方程和Hixson-Crowell方程擬合其釋放行為[13-15]，對其釋放機制進行預報，以期為后黃芩苷殼寡糖納米粒的臨床試驗研究和臨床使用提供一定的參考價值.

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

粒度分析儀(Nano-ZS90,英國馬爾文公司);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司)；紫外可見分光光度計(UV-1800，上海美譜達儀器有限公司)；高速冷凍離心機(H2100R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；電子分析天平(AR124CN，奧豪斯儀器(常州)有限公司)；真空冷凍干燥機(Freezone 6plus，美國LABCONCO公司)；超聲波清洗機(KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司)；GL-802A型微型臺式真空泵(GL-802A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；透射電子顯微鏡 (TECNAI G2 Spirit TWIN,捷克共和國FEI公司);黃芩苷標準品(110715-201016,上海金穗生物科技有限公司);殼寡糖(脫乙酰度>90%)(171010,青島云宙生物科技有限公司);三聚磷酸鈉(TPP，160820，天津市致遠化學試劑有限公司).

1.2 黃芩苷殼寡糖納米粒的制備

稱取適量殼寡糖溶解于10 mL超純水中，調節(jié)pH，配制成殼寡糖溶液(14 mg/mL).稱取1.4 mg黃芩苷加入4 mL 0.4 mg/mL三聚磷酸鈉溶液中，置于50 ℃恒溫水浴中保溫5 min.將上述配好的黃芩苷溶液以每秒一滴的速度逐滴加入，30 ℃攪拌10 min，即得負載黃芩苷的殼寡糖納米?；鞈乙?不加黃芩苷，同法制得空白納米粒.

1.3 黃芩苷殼寡糖納米粒體外釋放度的測定

1.3.1 釋放介質中黃芩苷的檢測方法 (1)標準曲線的繪制.稱取12.5 mg的黃芩苷，用PBS溶解，配制成濃度為2 mg/mL黃芩苷溶液.精密移取溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，用pH=7.4 的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋，分別稀釋成濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL的黃芩苷溶液.空白對照為PBS，分別測其在276 nm的吸光度.以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制黃芩苷的標準曲線.

(2)精密度試驗.稱取30 mg黃芩苷，用PBS溶解，配制成0.6 mg/mL黃芩苷儲備液.從儲備液中取出三份，用PBS稀釋，制備成濃度分別為6、12、18 μg/mL的黃芩苷溶液.并分別在0、2、4 h測定其在276 nm波長下的吸光度，每種濃度在一個時間點下測定3次，計算出日內精密度.連續(xù)3 d，在同一時間點測定276 nm波長下的吸光度，同樣每天每個樣品測定3次，計算出日間精密度.

(3)回收率試驗.從儲備液中取出3份，每份都加入100 μL空白納米粒，用PBS稀釋，制備成濃度分別為6、12、18 μg/mL的黃芩苷溶液，測定每個濃度在276 nm波長下的吸光度，代入標準曲線，計算回收率.

1.3.2 黃芩苷殼寡糖納米粒體外釋放的測定 將制備好的黃芩苷殼寡糖納米粒置于預處理過的透析袋中，取150 mL釋放介質，保持恒定溫度為37 ℃，分別于 0.5、1、2、4、8、12、24、36 h時間點取樣 2 mL，同時補加2 mL的釋放介質.將取出的樣品用釋放介質稀釋至10 mL裝入針筒中，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，在276 nm波長處下測定續(xù)濾液的吸光度值，將其代入標準曲線計算各個時間點釋放的黃芩苷的濃度，黃芩苷的累積釋放率Q按式(1)[16]計算，從而得出累積釋放率曲線.

(1)

其中：Ci為第i次取樣時釋放介質中黃芩苷的濃度，V為釋放介質的體積，V1為取樣的體積，M為黃芩苷初始的質量.

1.3.3 模型擬合分析 采用Origin Pro 8軟件對體外釋放情況進行模型擬合分析.

2 結果與討論

圖1 黃芩苷殼寡糖納米粒的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM image of Baicalin chitosan oligosaccharide nanoparticles

2.1 黃芩苷殼寡糖納米粒形態(tài)觀察

取適量黃芩苷殼寡糖納米?；鞈乙?，稀釋至一定倍數(shù)后滴在銅網(wǎng)上，靜置5 min后，用濾紙吸干，滴加磷鎢酸染色.常溫下自然晾干，采用透射電鏡觀察納米粒形態(tài)[17].納米粒的透射電鏡照片(圖1)顯示，黃芩苷殼寡糖納米粒形態(tài)為均一、圓整球形，分散性好，平均粒徑約為50 nm.

2.2 黃芩苷殼寡糖納米粒的粒徑及Zeta電位

用激光粒度分析儀測定黃芩苷殼寡糖納米粒的粒徑及Zeta電位，結果見圖2和圖3.黃芩苷殼寡糖納米粒平均粒徑測定為(63.2±2.7) nm，測得的粒徑比透射電鏡觀察結果大，原因是測定條件為濕態(tài).Zeta電位測定結果為(+19.6±0.6) mV，說明黃芩苷殼寡糖納米粒分散性和穩(wěn)定性較好.

圖2 黃芩苷殼寡糖納米粒粒徑分布圖 圖3 黃芩苷殼寡糖納米粒Zeta電位Fig.2 Size distribution of Baicalin chitosan oligosaccharide nanoparticles Fig.3 Zeta potential of Baicalin chitosan oligosaccharide nanoparticles

2.3 釋放介質中黃芩苷含量的測定

2.3.1 檢測波長的確定 制備空白納米粒及黃芩苷殼寡糖納米粒，用紫外分光光度計掃描二者在200～400 nm的波長下的吸光度，結果如圖4所示.由圖中可知，黃芩苷在276 nm處有最大吸收波長，與空白納米粒對比，在此波長下二者的吸光度相差較大，說明在此波長下，其他干擾物質對黃芩苷測定的影響小，所以選用276 nm為黃芩苷的測定波長.

圖4 黃芩苷殼寡糖納米粒和空白納米粒的波長掃描圖 圖5 黃芩苷的標準曲線 Fig.4 Ultraviolet scanning figure of Baicalin chitosan oligosaccharide nanoparticles and blank nanoparticles Fig.5 Standard curve of Baicalin

2.3.2 黃芩苷含量測定 按照“1.3.1(1)”項,以吸光度為縱坐標,以濃度為橫坐標，繪制黃芩苷標準曲線為y=0.052 8x+0.001 7，R2=0.999 2，如圖5所示.由圖中可知，黃芩苷在5～50 μg/mL內濃度與吸光度的線性關系良好.精密度試驗測得6、12、18 μg/mL黃芩苷溶液的日內精密度相對標準偏差(RSD)分別為1.90%、1.49%、1.79%，日間精密度RSD分別為3.09%、1.02%、0.66%.回收率的測定結果表明，6、12、18 μg/mL黃芩苷溶液回收率的平均值分別為102.81%、106.12%、108.74%，RSD分別為3.07%、0.66%、1.24%.說明用紫外分光光度法測定殼寡糖納米體系中黃芩苷濃度的精密度和回收率符合要求.

圖6 黃芩苷溶液和黃芩苷殼寡糖納米粒的釋放情況Fig.6 Release of Baicalin solution and Baicalin oligosaccharide nanoparticles

2.4 體外釋放情況

采用透析法對比黃芩苷溶液與黃芩苷殼寡糖納米粒的釋放情況，結果如圖6所示.由圖中可知，黃芩苷溶液呈現(xiàn)較快的釋放速度，6 h時黃芩苷溶液的累積釋放率就達到了97.34 %，而8 h時黃芩苷殼寡糖納米粒的累積釋放率為74.09%，到36 h時才達到92.81%.可見黃芩苷殼寡糖納米粒相對于黃芩苷溶液釋放慢，具有明顯的緩釋效果.

2.5 模型擬合分析

為了進一步闡明黃芩苷溶液和黃芩苷殼寡糖納米粒的體外釋藥特性，探討其藥物釋放機理，在上述結果的基礎上通過 Origin 2018對體外釋藥結果進行數(shù)據(jù)分析，采用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程、雙相動力學方程、Ritger-Peppas方程和Hixson-Crowell方程對黃芩苷溶液和黃芩苷殼寡糖納米粒的體外釋放情況進行模型擬合[18]，結果見表1，擬合效果如圖7和圖8.藥物釋放曲線擬合的效果用相關系數(shù)R2表示，R2越接近于1，擬合程度越高，藥物釋放曲線與對應方程的擬合效果越好[19].

表1 黃芩苷溶液與黃芩苷殼寡糖納米粒體外釋放的擬合結果Tab.1 Fitting results of in vitro release of Baicalin solution and Baicalin chitosan oligosaccharide nanoparticles

由表1擬合結果顯示，黃芩苷溶液的藥物釋放更接近一級動力學方程，相關系數(shù)R2為0.986 4.表明黃芩苷溶液在釋放過程中以擴散為主.而雙相動力學方程的相關系數(shù)僅為0.279 5；說明黃芩苷溶液釋放快，而不存在突釋效應，沒有緩釋相.

圖7 黃芩苷溶液體外釋放的擬合情況Fig.7 Fitting of in vitro release of Baicalin solution

黃芩苷殼寡糖納米粒的體外釋放更接近雙相動力學方程，相關系數(shù)達到0.995 9，表明黃芩苷殼寡糖納米粒的釋放先快后慢，一開始釋放納米粒表面吸附的黃芩苷，后黃芩苷通過納米粒表面孔道或載體開始溶解慢慢釋放[20]；一級動力學方程的相關系數(shù)為0.956 9，說明納米粒的釋放以擴散為主；Ritger-Peppas方程擬合的相關系數(shù)為0.899 7，且n=0.298 9±0.045，n<0.45說明納米粒的釋放為Fick’s擴散，其釋放機制以擴散為主[21-22]，但相關系數(shù)僅為0.899 7，表明可能還有一部分以溶蝕釋放；Hixson-Crowell方程擬合的納米粒的相關系數(shù)為0.834 3，說明藥物釋放過程中，擴散速度是藥物釋放的限速步驟，但也存在其他的限制過程，這與前面的分析相吻合.

圖8 黃芩苷殼寡糖納米粒體外釋放的擬合情況Fig.8 Fitting of in vitro release of Baicalin chitosan oligosaccharide nanoparticles

3 討論

本研究所得黃芩苷殼寡糖納米粒形態(tài)較規(guī)整，粒徑均一，激光粒度儀所測的是納米粒的水合粒徑，故比透射電鏡所得的粒徑稍大.從體外釋放結果可知，納米粒藥物釋放持續(xù)而穩(wěn)定，具有明顯的緩釋作用.本文采用其中6種經(jīng)典模型[23-24]對黃芩苷溶液和黃芩苷殼寡糖納米粒的釋放數(shù)據(jù)進行擬合.釋放模型擬合結果(雙相動力學方程擬合的相關系數(shù)達到0.995 9)表明黃芩苷殼寡糖納米粒的釋放機理：前期由于納米粒表面有黃芩苷吸附，釋藥快，之后從納米粒表面小孔釋放，同時載體溶解從表面孔道擴散釋放，溶解緩慢將黃芩苷釋放出來.