施德鋒，樂治平，馬從蓮，羅琪，姜峰

(南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

白藜蘆醇，化學(xué)名為3，5，4’-三羥基二苯乙烯(3,5,4’-trihydroxystilbene)[1]，是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚類化合物[2]。越來越多的研究表明白藜蘆醇具有抗心血管疾病、抗癌、抗氧化、抗炎、抗血小板凝集、降血脂、抗糖尿病、抗神經(jīng)退行性疾病、抗乙醇誘導(dǎo)的遺傳毒性等藥理活性[3-5]。白藜蘆醇已在許多植物中被發(fā)現(xiàn)，比如虎杖、花生、越橘屬、葡萄和桑葚等[4,6-9]。

我國花生種植區(qū)域廣泛，花生資源十分豐富。2019年,我國花生產(chǎn)量超過1 700萬t，花生產(chǎn)量和單產(chǎn)位居世界第一，占世界花生總產(chǎn)量的39.2%[10-12]。江西樟樹市是全國花生高產(chǎn)創(chuàng)建示范縣、國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系示范縣，也是江西省三大花生主產(chǎn)區(qū)之一。2017年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)對(duì)“樟樹花生”實(shí)施農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù)。

花生消費(fèi)方式主要是榨油和食用[11]，但它的根和莖作為花生收獲后的廢棄物往往會(huì)被人們忽視。實(shí)際上，這些廢棄物中含有許多對(duì)人體健康有益的天然活性化合物，如芪類、黃酮類等[13-14]。當(dāng)前白藜蘆醇的提取方法主要有超聲法、微波法、酶法、超臨界CO2萃取等，但還未有將酶、超聲法和環(huán)糊精共同作用于提取白藜蘆醇。因此，本文以乙醇為提取溶劑，同時(shí)輔以酶、β-環(huán)糊精，超聲下提取樟樹花生根中的白藜蘆醇，進(jìn)一步提高白藜蘆醇提取率，以確定國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品的組成特性，并為花生廢棄物的資源化利用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

花生芽和花生植株(江西樟樹吳城)；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(99%，麥克林)；無水乙醇(西隴科技股份有限公司)；β-環(huán)狀糊精(食品級(jí)，鄭州食全食美食品有限公司)；纖維素酶(食品級(jí)，匯泉生物科技有限公司)；半纖維素酶(食品級(jí)，匯泉生物科技有限公司)；水為純水。

UV-5500PC紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；高速多功能粉碎機(jī)(武義海納電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料制取

將樣品用清水洗凈于鼓風(fēng)干燥箱中充分干燥。用粉碎機(jī)粉碎，過0.250 mm篩后，用密封袋將其保存在0～8 ℃環(huán)境中，備用。提取白藜蘆醇前，要先用石油醚對(duì)其進(jìn)行脫脂。

1.2.2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將準(zhǔn)確稱取的25.2 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解并定容到250 mL容量瓶中,得到1.008 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶,用無水乙醇稀釋到刻度線，搖勻,得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無水乙醇作參比,在最大吸收波長(zhǎng)306 nm處測(cè)定其對(duì)應(yīng)的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸光度值A(chǔ)和白藜蘆醇質(zhì)量濃度C的關(guān)系曲線回歸方程為:A=0.124 1C-0.018 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。這表明白藜蘆醇標(biāo)樣質(zhì)量濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3 超聲波法輔助提取法白藜蘆醇[15-16]

稱取一定量的石油醚脫脂后的花生樣品粉末，先分別考察花生各組分中的白藜蘆醇含量，確定白藜蘆醇含量最大組分，再按單因素實(shí)驗(yàn)分別考察超聲功率(20，40，60，80，100 W)、超聲時(shí)間(20，30，40，50，60，70，80 min)、料液比(1:20，1:30，1:40，1:50 g·mL-1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(60%，65%，70%，75%，80%)、超聲溫度(30，40，50，60，70 ℃)等對(duì)提取率的影響。提取完畢后，離心，從上清液中取0.2 mL樣液于10 mL容量瓶用無水乙醇定容，并以無水乙醇為參比，在波長(zhǎng)306 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算提取率。圖1為白藜蘆醇測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

白藜蘆醇質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)圖1 白藜蘆醇測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of resveratrol

1.2.4 超聲波-酶法輔助提取白藜蘆醇[17]

稱取一定量的石油醚脫脂后的花生樣品粉末，按單因素實(shí)驗(yàn)分別按酶添加量(1%，2%，3%，4%，5%)、酶種類(纖維素酶、半纖維素酶)、酶配比對(duì)花生樣品進(jìn)行酶解，在35 ℃水浴中酶解60 min。酶解后，加入乙醇溶液，在超聲波法輔助提取白藜蘆醇的最優(yōu)條件下，進(jìn)行超聲波提取。提取完畢后，按1.2.3中的方法來測(cè)定并計(jì)算提取率。

1.2.5 超聲波-β-環(huán)狀糊精法輔助提取白藜蘆醇[15]

稱取一定量的石油醚脫脂后的花生樣品粉末，在超聲波法輔助提取白藜蘆醇的條件下，考察β-環(huán)狀糊精用量(1:0.015，1:0.030，1:0.045，1:0.060，1:0.075，1:0.090，1:0.105 g·mmol-1)對(duì)提取率的影響，分別量取0，0.5，1.0，1.5，2，2.5，3.0，3.5 mL β-環(huán)狀糊精溶液(0.01 mol·L-1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 超聲波-β-環(huán)狀糊精-酶法輔助提取白藜蘆醇

稱取一定量的石油醚脫脂后的花生樣品粉末，在超聲波法輔助提取白藜蘆醇的最優(yōu)條件、酶最佳配比和添加量以及β-環(huán)狀糊精(0.01 mol·L-1)最佳用量下，完成對(duì)花生樣品的提取。提取完畢后，按1.2.3中的方法測(cè)定并計(jì)算提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生各組分中白藜蘆醇含量影響

在樣品0.33 g、超聲溫度60 ℃、超聲功率80 W、超聲時(shí)間50 min、料液比1:60 g·mL-1、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，探知花生芽不同生長(zhǎng)長(zhǎng)度的芽莖(芽1(0～2 cm)、芽2(2～4 cm)、芽3(4～6 cm))、芽根、紅衣和花生植株各組分中白藜蘆醇的含量。

組分類別圖2 花生各組分中的白藜蘆醇含量Fig.2 Resveratrol content in peanut buds and peanut plants

可以看出，花生芽的根部白藜蘆醇含量最高，其次是花生植株的根部中白藜蘆醇的含量。從圖中還可以看出，芽1、芽2和芽3中白藜蘆醇提取率接近，說明花生芽莖的生長(zhǎng)長(zhǎng)度對(duì)白藜蘆醇含量的影響不大，花生果肉外層的紅衣、花生植株的莖和葉中含有的白藜蘆醇都較低。在工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到原料的獲取，選擇花生植株的根部作為白藜蘆醇的主要獲取來源比較合理。

2.2 超聲功率對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

在花生根0.4 g、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間60 min、料液比1:50 g·mL-1、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究超聲功率對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響，結(jié)果見圖3。

超聲波能夠破壞植物細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物釋放到提取介質(zhì)中，并且細(xì)胞破碎顯著增加了接觸面積，加速了目標(biāo)提取物向提取溶劑的傳質(zhì)速率。當(dāng)聲波功率增大時(shí)，聲強(qiáng)會(huì)變大，空化氣泡的半徑與起始半徑會(huì)變大，空化強(qiáng)度增強(qiáng)，即聲強(qiáng)越高，空化越強(qiáng)，從20 W上升到80 W過程中，白藜蘆醇的提取率逐漸增大，80 W時(shí)，提取率達(dá)到最大。但并不是功率越大，超聲提取效果越好，在80 W后，超聲對(duì)白藜蘆醇的提取率迅速下降，這可能是由于空化氣泡破裂產(chǎn)生的局部高壓和高溫導(dǎo)致白藜蘆醇的降解[18]。

超聲功率/W圖3 超聲功率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power

2.3 超聲時(shí)間對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

在花生根0.4 g、超聲功率100 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:50 g·mL-1、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響，結(jié)果如圖4。

超聲時(shí)間/min圖4 超聲時(shí)間的影響Fig.4 Effect of ultrasound time

白藜蘆醇的提取率隨著超聲波作用時(shí)間延長(zhǎng)呈先增長(zhǎng)后降低的變化規(guī)律。當(dāng)功率一定時(shí)，隨著超聲波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇的提取率也在逐漸增加。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，提取率達(dá)到最大；再增加時(shí)長(zhǎng)，白藜蘆醇提取率開始降低，這可能是由于超聲時(shí)間過長(zhǎng)，已溶出的白藜蘆醇部分降解[18]。因此，實(shí)驗(yàn)應(yīng)控制超聲時(shí)間在50 min。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

提取白藜蘆醇的常用溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等，現(xiàn)在還出現(xiàn)了綠色溶劑[19]，但考慮到提取溶劑應(yīng)具有安全無毒、低價(jià)易回收、獲取便捷等特點(diǎn)，最終選擇了乙醇作為提取白藜蘆醇的試劑。查閱文獻(xiàn)獲知60%～90%乙醇水溶液對(duì)白藜蘆醇的提取較為常用。因此，在花生根0.4 g、超聲功率100 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃、料液比1:50(g·mL-1)的條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響。

從圖5可以看出，在60%～70%乙醇對(duì)白藜蘆醇提取率逐漸增大，70%乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生根中的白藜蘆醇提取效果最佳；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，白藜蘆醇提取率迅速降低后，漸趨于平緩。這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)變化，溶劑極性隨之變化，花生根中的其他醇溶性物質(zhì)也隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化而溶出，與白藜蘆醇形成了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，白藜蘆醇提取率因此呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)[20]。

乙醇體積分?jǐn)?shù)/%圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration

2.5 超聲溫度對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

在花生根0.4 g、超聲功率100 W、超聲時(shí)間60 min、料液比1:50(g·mL-1)、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究超聲溫度對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響。

從圖6可知，超聲提取1 h，白藜蘆醇的提取率隨溫度的升高而不斷增大。但是考慮到花生根中白藜蘆醇的提取率，乙醇的揮發(fā)性，超聲清洗機(jī)難以達(dá)到并穩(wěn)定在70 ℃等因素，最終選擇60 ℃作為提取白藜蘆醇的提取溫度。

超聲溫度/℃圖6 超聲溫度的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature

2.6 料液比對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

在花生根0.4 g、超聲功率100 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究料液比對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響。

由圖7可知，當(dāng)料液比從1:10(g·mL-1)增加到1:70(g·mL-1)，白藜蘆醇的提取率也一直在增大；在超過1:60(g·mL-1)后，提取率增大有變緩的趨勢(shì)?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)成本和提取率，選擇1:60(g·mL-1)作為提取白藜蘆醇的料液比。

液料比/(mL·g-1)圖7 料液比的影響Fig.7 Effect of material-to-liquid ratio

2.7 β-環(huán)糊精用量對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

如圖8所示，在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超聲功率100 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究β-環(huán)狀糊精用量對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響。

β-五糊精用量/mL圖8 β-環(huán)糊精用量的影響Fig.8 Effect of β-cyclodextrin dosage

可知，β-環(huán)糊精(0.01 mol·L-1)的添加明顯影響到花生根中白藜蘆醇的提取率，這可能是由于白藜蘆醇溶出后被β-環(huán)狀糊精包合，從而進(jìn)一步促進(jìn)了花生根中殘余白藜蘆醇的溶出。在環(huán)糊精添加量逐漸增加到2.5 mL時(shí)，即β-環(huán)狀糊精用量比例增大至1:0.075(g·mmol-1)，白藜蘆醇的提取率達(dá)到最大；繼續(xù)增大添加量時(shí)，提取效果逐漸變差。這是由于花生根中含有豐富的多酚類物質(zhì)也會(huì)與環(huán)糊精包合，從而影響到白藜蘆醇的包合溶出；再繼續(xù)加大環(huán)糊精的用量后，由于環(huán)糊精在乙醇水溶液中的溶解度有限，白藜蘆醇的提取率趨于平穩(wěn)[21-22]。因此，選擇花生根用量與β-環(huán)狀糊精用量1:0.075(g·mmol-1)的比例來輔助提取白藜蘆醇。

2.8 酶配比對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超聲功率80 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究酶配比對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響。

纖維素酶和半纖維素酶能作用于細(xì)胞的細(xì)胞壁，使構(gòu)成植物細(xì)胞壁的多糖類水解，從而方便細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出[23]。由圖9可知，纖維素酶單獨(dú)作用的效果優(yōu)于半纖維素酶，也優(yōu)于兩種酶共同作用的效果。

m(纖維素酶)：m(半纖維素酶)圖9 酶配比的影響Fig.9 Effect of enzyme ratio

2.9 酶添加量對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的影響

在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超聲功率80 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，研究酶添加量對(duì)花生根中白藜蘆醇提取率的影響。

由圖10可知，在纖維素酶添加量由1%增大到2%時(shí)，白藜蘆醇的提取率增大并達(dá)到最大，提取率為0.52%，繼續(xù)增加纖維素酶的用量，作用效果迅速下降后逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)槊柑砑恿窟_(dá)到一定量后，其底物濃度相對(duì)不能飽和，酶作用效果從而減弱。

酶添加量/%圖10 酶添加量的影響Fig.10 Effect of enzyme addition

2.10 不同提取方法對(duì)提取花生根中白藜蘆醇含量的效果比較

為篩選出更為合理的提取方法，在花生根0.33 g、料液比1:60(g·mL-1)、超聲功率80 W、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度60 ℃、70%乙醇體積分?jǐn)?shù)下，比較分別單獨(dú)使用2%纖維素酶和25 mLβ-環(huán)狀糊精(0.1 mol·L-1)，即β-環(huán)狀糊精用量1:0.075(g·mmol-1)及聯(lián)合使用兩者的條件下，對(duì)花生根中提取白藜蘆醇的影響，結(jié)果列于圖11。

酶添加量/%圖11 不同提取方法提取白藜蘆醇Fig.11 Different extraction methods to extract resveratrol

由圖11可知，β-環(huán)狀糊精和纖維素酶形成了較好的協(xié)同作用，互相促進(jìn)了各自作用效果，使得β-環(huán)糊精和纖維素酶協(xié)同作用下的效果優(yōu)于單獨(dú)使用纖維素酶或β-環(huán)狀糊精的效果，其中單獨(dú)使用纖維素酶提取白藜蘆醇的效果在這3種方法中最差。

3 結(jié)論

以國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品——樟樹花生為對(duì)象，測(cè)定其相關(guān)組分中白藜蘆醇的含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比等因素對(duì)花生根中提取白藜蘆醇的影響，并優(yōu)化了工藝條件。發(fā)現(xiàn)采用超聲波-β-環(huán)狀糊精-酶法輔助提取白藜蘆醇，在2%纖維素酶、β-環(huán)狀糊精用量1:0.075(g·mmol-1)、70%乙醇、料液比1:60(g·mL-1)、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間50 min、超聲功率80 W的最佳工藝條件下，白藜蘆醇的提取率為0.587%。