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(哈爾濱商業(yè)大學(xué),食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

α - 亞麻酸(α - Linolenic acid)即9,12,15 - 十八碳三烯酸,它是一種高級多不飽和脂肪酸,分子式為CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH[1]。它以甘油酯的形式存在于亞麻籽油、蘇子油等干性油中,為淡黃色液體,熔點 - 11. 3℃,沸點230 ～ 232℃(17mmHg),相對密度0. 9164,可溶于乙醇和乙醚。α - 亞麻酸是一種人體自身無法合成的必需脂肪酸,它是維系人類腦進(jìn)化的核心物質(zhì),到達(dá)α - 亞麻酸代謝的歷程終端,將形成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,即EPA和DHA[2],這兩者都是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成成分。其中,EPA具有降低血脂和改善血小板凝固的作用,可預(yù)防腦血栓和心肌梗塞等疾病。自上個世紀(jì)80年代以來被公認(rèn)為人類有效的保健食品之一。而DHA則具有促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、視網(wǎng)膜反射能力和提高記憶力、預(yù)防癌癥、預(yù)防老年癡呆癥和抗過敏癥等功效[3]。

近年來,β - 環(huán)糊精包合技術(shù)的主要原理是利用物質(zhì)擴(kuò)散至β - 環(huán)糊精的空穴中,形成環(huán)糊精的包合進(jìn)行純化,它可與許多無機(jī)、有機(jī)分子結(jié)合成主客體包合物,并能改變被包合物的化學(xué)及物理性質(zhì),具有穩(wěn)定、保護(hù)、增溶客體分子和選擇性定向分子的特性[4],因而β - 環(huán)糊精包合技術(shù)在食品、醫(yī)藥、環(huán)境、高分子合成、化妝用品以及化學(xué)檢測等方面都有廣泛的應(yīng)用[5]。利用環(huán)糊精包埋復(fù)合物的研究趨于成熟,并開始在某些領(lǐng)域得到應(yīng)用。環(huán)糊精最常見的主要有環(huán)糊精α、β、γ三種,其中β - 環(huán)糊精應(yīng)用最為廣泛[6]。不管是在國外還是國內(nèi)市場,α - 亞麻酸都具有廣泛需求,且人們對其進(jìn)行提取、純化的方法具有多樣性[7]。因此,本實驗對β - 環(huán)糊精包合法純化混合脂肪酸中α - 亞麻酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,利用響應(yīng)曲面法進(jìn)一步優(yōu)化提取方法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

亞麻籽油 市售;無水乙醇 分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 分析純,黑龍江阿城化學(xué)試劑廠;鹽酸 優(yōu)級純,哈爾濱新達(dá)化工廠;無水乙醚 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;無水硫酸鈉 分析純,天津塘沽鄧中化工廠;β - 環(huán)糊精 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;混合脂肪酸 亞麻籽油提取得到。

DK - 98 - 1型電子恒溫水浴箱 天津市泰斯特儀器有限公司;ALC - 1100. 2型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;便攜式pHS - 3C型數(shù)字精密pH計 中國上海儀器廠;TU - 1900型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;R - 205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司;MC型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DHG - 9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;KQ - 500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 α - 亞麻酸定量分析實驗

1. 2. 1. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取不同體積濃度為為0. 2mg/mL的α - 亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,定容至25mL。分別于最大吸收波長處測其吸光值,以α - 亞麻酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),最大吸收波長下的吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 2. 1. 2 α - 亞麻酸含量的測定 α - 亞麻酸的含量計算方程如下:

注:W- α - 亞麻酸含量/%;m- 富含α - 亞麻酸的質(zhì)量/g;M- 亞麻油混合脂肪酸的質(zhì)量/g。

1. 2. 2 β - 環(huán)糊精包合法提取α - 亞麻酸單因素實驗

1. 2. 2. 1 包合溫度對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量的β - 環(huán)糊精各18g放入燒杯中,加入適量的熱水配成飽和溶液,在恒溫條件下,分別攪拌至規(guī)定溫度(30、40、50、60、70℃),然后分別加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇的混合液,恒溫攪拌2h,冷卻后置于冰箱中冷凍18h,待溶化后抽濾洗滌,置于80℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥3h后,得到白色粉末狀α - 亞麻酸 - β - 環(huán)糊精包合物。將包合物置于燒瓶中,加適量乙醚,在40℃恒溫水浴鍋中回流1h,減壓抽濾回收乙醚,即得富含α - 亞麻酸的脂肪酸[8]。

1. 2. 2. 2 β - 環(huán)糊精用量對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量分別為2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇配成混合溶液。按照β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)的不同比例,分別稱取一定量(12、15、18、21、24g)的β - 環(huán)糊精,在恒溫條件下攪拌至50℃后,加入混合液恒溫攪拌2h,冷卻后置冰箱冷凍18h,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 2. 3 包合時間對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量的β - 環(huán)糊精各18g放入燒杯中,加入適量熱水配成飽和溶液,在恒溫條件下攪拌至50℃,分別加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇的混合液,恒溫攪拌一定時間(1、1. 5、2、2. 5、3h),冷卻后置冰箱中冷凍18h,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 2. 4 冷凍時間對α - 亞麻酸含量的影響 稱取5份等量的β - 環(huán)糊精各18g放入燒杯中,加入適量熱水配成飽和溶液,恒溫攪拌至50℃后,加入2g混合脂肪酸(FFA)和1g無水乙醇的混合溶液,恒溫攪拌2h,冷卻后置于冰箱中冷凍一定時間(6、12、18、24、30h)后,之后方法同1. 2. 2. 1。

1. 2. 3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化α - 亞麻酸提取工藝條件 采用Box - Behnken模型,以包合溫度、包合時間和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量之比三個單因素為影響α - 亞麻酸含量的主要考察因子(自變量),分別以x1、x2、x3表示,并以 - 1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平,按方程xi=(xi- xo)/x對自變量進(jìn)行編碼。其中xi為自變量的編碼值,Xi為自變量的真實值,xo為實驗中心點處自變量的真實值,x為自變量的變化步長,因子編碼及水平見表1。并采用多元回歸分析,擬合二次多項式回歸模型的Box -Behnken設(shè)計實驗[9 - 10],進(jìn)行結(jié)果分析,得到β - 環(huán)糊精包合法分離亞麻油中α - 亞麻酸的優(yōu)化工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2. 1 α - 亞麻酸定量分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果:在300nm下測定不同濃度α - 亞麻酸標(biāo)樣的吸光值,擬合得回歸方程:y=0. 0047x+0. 0804(R2=0. 9973),有效線性范圍:70 ～310μg/mL,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 α - 亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of α - linolenic acid

2. 2 β - 環(huán)糊精包合法提取α - 亞麻酸單因素實驗

2. 2. 1 包合溫度對α - 亞麻酸含量的影響 從圖2中可以看出,隨著包合溫度在30 ～ 60℃之間逐步上升,α - 亞麻酸的含量顯示出逐漸增加的趨勢,這是因為β - 環(huán)糊精包合物的形成是一個吸熱過程,溫度增高時,反應(yīng)向生成β - 環(huán)糊精包合物的方向進(jìn)行,包合溫度隨不飽和度的增加而增加,包合溫度的增長有利于不飽和脂肪酸與β - 環(huán)糊精形成包合物。當(dāng)溫度高于60℃時,β - 環(huán)糊精的包合能力開始下降,α - 亞麻酸的含量開始降低。由此可見,包合溫度為60℃時,提取效果最佳,α - 亞麻酸的含量為38. 4%。

圖2 包合溫度對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 2 The effect of bonding temperature to α - linolenic acid content

2. 2. 2 包合時間對α - 亞麻酸含量的影響結(jié)果與分析 從圖3中可以看出,在1 ～ 2h之間,α - 亞麻酸的含量呈上升趨勢,即隨著包合時間的延長,更有利于不飽和脂肪酸與β - 環(huán)糊精形成包合物。當(dāng)包合時間為2h時,β - 環(huán)糊精與不飽和脂肪酸達(dá)到了最佳的包合狀態(tài),此時提取效果最好,α - 亞麻酸的含量為50. 8%,之后隨著時間的增加,β - 環(huán)糊精失去了包合的能力,開始不再對不飽和脂肪酸進(jìn)行包合,α - 亞麻酸的含量也開始逐漸降低,由此可見,2h為α - 亞麻酸的最佳包合時間。

圖3 包合時間對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 3 The effect of inclusion time to α - linolenic acid content

2. 2. 3 β - 環(huán)糊精用量對α - 亞麻酸含量的影響結(jié)果與分析 從圖4中可以看出,當(dāng)β - 環(huán)糊精的用量在12 ～ 21g之間增加時,α - 亞麻酸的含量也在逐漸增加,這是由于β - 環(huán)糊精包合不飽和脂肪酸的能力在不斷增強(qiáng),直到其達(dá)到最佳的包合程度,此時,β - 環(huán)糊精用量為21g時,α - 亞麻酸的含量為51. 5%。但是,當(dāng)β - 環(huán)糊精用量超過21g之后,β - 環(huán)糊精包合能力開始下降,這時α - 亞麻酸的含量也開始下降。這是由于β - 環(huán)糊精與液體的用量比不隨溫度或在加成前其他組份的濃度而變化,β - 環(huán)糊精與脂肪酸的比隨脂肪酸的飽和度不同而不同。

圖4 β - 環(huán)糊精用量對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 4 The effect of β - cyclodextrin dosage to α - linolenic acid content

2. 2. 4 冷凍時間對α - 亞麻酸含量的影響結(jié)果與分析 從圖5中可以看出,在相同條件下,隨著冷凍時間的延長,有利于β - 環(huán)糊精對不飽和脂肪酸的包合,在6 ～ 18h之間,α - 亞麻酸的含量一直在增加,當(dāng)冷凍時間增加到18h時,具有最佳的提取效果,α - 亞麻酸的含量為47. 8%,此時,β - 環(huán)糊精對不飽和脂肪酸的包合能力已達(dá)到極限。之后隨著冷凍時間的增加,β - 環(huán)糊精包合能力下降,α - 亞麻酸的含量逐漸下降。由此可以得出結(jié)論:18h為α - 亞麻酸的最佳冷凍時間。

圖5 冷凍時間對α - 亞麻酸含量的影響Fig. 5 The effect of freeze time to α - linolenic acid content

2. 3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化α - 亞麻酸提取工藝條件結(jié)果與分析

2. 3. 1 回歸模型的建立 經(jīng)過對包合溫度、包合時間、β - 環(huán)糊精用量以及冷凍時間四個因素進(jìn)行方差分析,得出:冷凍時間對α - 亞麻酸的含量沒有顯著性的影響,因此,在接下來的響應(yīng)曲面實驗中將不再將冷凍時間作為主要因素加以考慮。

利用Design Expert軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得β - 環(huán)糊精法提取α - 亞麻酸的包合溫度(x1)、包合時間(x2)和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量之比(x3)的二次多項回歸模型方程為:

Y=69. 74 - 0. 62x1+2. 72x2+1. 96x3- 0. 93x1x2+0. 24x1x3+0. 49x2x3- 1. 28x12- 2. 64x22- 9. 43x32

2. 3. 2 方差分析 通過Design - Expert軟件進(jìn)行誤差分析,以驗證模型的顯著性,結(jié)果見表4及表5。

表3 實驗設(shè)計與結(jié)果表Table 3 Design and results of experiment

表4 響應(yīng)面模型方差分析表Table 4 Response surface model analysis of variance table

注:p<0. 0001 極顯著,p<0. 05顯著,表5同。

從表5回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知,模型一次項x2、x3極顯著,x1顯著;交互項x1x2、x2x3顯著,x1x3不顯著;二次項x12、x22、x32均極顯著。

2. 3. 3 α - 亞麻酸質(zhì)量濃度的響應(yīng)面分析

2. 3. 3. 1 包合溫度與包合時間交互作用 由圖6可知,在β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量比值為最佳值7. 14∶ 1時,包合溫度與包合時間對α - 亞麻酸含量的交互影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著。其中,包含溫度對α - 亞麻酸含量的影響不大;而隨著包合時間的增加,α - 亞麻酸的含量逐步提高,當(dāng)包合時間較短時,α - 亞麻酸的含量包合時間的增加而增大,但當(dāng)包合時間超過2. 18h時,α - 亞麻酸的含量隨包合時間的增加而減小。在實驗水平范圍內(nèi),包合溫度和包合時間分別在59 ～ 61℃和1. 5 ～ 2. 5h范圍內(nèi)時,α - 亞麻酸的含量可以達(dá)到實驗中的最大值。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 5 Significance test of the regression equation coefficients

圖6 包合溫度、包合時間及其交互作用對α - 亞麻酸含量影響的響應(yīng)曲面Fig. 6 Influence of bonding temperature,inclusion time and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

2. 3. 3. 2 包合溫度與β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比交互作用 由圖7可知,在包合時間為最佳值2. 18h時,包合溫度與β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)對α - 亞麻酸含量的交互影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用不顯著。在實驗水平范圍內(nèi),包合溫度對α - 亞麻酸的含量的影響不大。當(dāng)β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)比較低時,α - 亞麻酸的含量隨β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)比的增大而增大,但當(dāng)包合溫度超過59. 71℃時,α - 亞麻酸的含量隨β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)比的增大而減小。在實驗水平范圍內(nèi),包合溫度和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量之比分別在59 ～61℃和6∶ 1 ～ 8∶ 1范圍內(nèi)時,α - 亞麻酸的含量可以達(dá)到實驗中的最大值。

2. 3. 3. 3 包合時間與β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比交互作用 由圖8可知,在包合溫度為最佳值59. 71℃時,包合時間與β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)對α - 亞麻酸含量的交互影響效應(yīng)。從其等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著。隨著β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比值的增加,α - 亞麻酸的含量也逐步提高,當(dāng)β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)用量比值超過7. 14∶ 1時,α - 亞麻酸的含量開始減小。在實驗水平范圍內(nèi),包合時間和β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的比值分別在1. 5 ～ 2. 5h和6∶ 1 ～ 8∶ 1的范圍內(nèi)時,α - 亞麻酸的含量可以達(dá)到實驗中的最大值。

圖7 包合溫度、β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)及其交互作用對α - 亞麻酸含量影響的響應(yīng)面Fig. 7 Influence of bonding temperature,the ratio of β - cyclodextrin with mixed fatty acids and ethanol consumption and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

圖8 包合時間、β - 環(huán)糊精:(FFA+無水乙醇)及其交互作用對α - 亞麻酸含量影響的響應(yīng)面Fig. 8 Influence of inclusion time,the ratio of β - cyclodextrin with mixed fatty acids and ethanol consumption and their interactions on the response surface of the α - linolenic acid content

2. 3. 4 驗證實驗結(jié)果分析 根據(jù)回歸方程及上述分析,響應(yīng)面存在最大值,可得α - 亞麻酸純化的最佳工藝條件,即:包合溫度59. 71℃,包合時間2. 18h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量之比為7. 14∶ 1,得到α - 亞麻酸的含量為71. 47%。優(yōu)化此工藝條件,即:包合溫度60℃,包合時間2. 2h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量之比為7. 14∶ 1,采用此工藝做驗證實驗,結(jié)果如表6所示。

表6 回歸模型驗證實驗結(jié)果表Table 6 Table results of test model

由表6可看出,采用此工藝條件進(jìn)行驗證實驗,得到α - 亞麻酸的含量為71. 45%,與理論值相差不大,因此確定最佳工藝條件為包合溫度60℃,包合時間2. 2h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量之比為7. 14∶ 1。

3 結(jié)論

以亞麻籽油為原料,研究β - 環(huán)糊精包合法純化α - 亞麻酸的最佳工藝條件。通過紫外譜掃描確定α - 亞麻酸的最大波長為300nm。通過單因素實驗確定α - 亞麻酸的最佳純化工藝條件:即包合溫度60℃,包合時間2h,β - 環(huán)糊精用量21g,冷凍時間18h為最優(yōu)條件。通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化α - 亞麻酸的提取純化工藝條件:即包合溫度60℃,包合時間2. 2h,β - 環(huán)糊精與(FFA+無水乙醇)的用量比為7. 14∶ 1的數(shù)據(jù)結(jié)果顯著,得到α - 亞麻酸的含量為71. 45%。

[1]楊靜,常蕊. α - 亞麻酸的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程,2011(1):72 - 76.

[2]郭永利,范麗娟. 亞麻籽的保健功效和藥用價值[J]. 中國麻業(yè)科學(xué),2007,29(3):147 - 149.

[3]趙利,黨占海,李毅. 亞麻籽的保健功能和開發(fā)利用[J]. 中國油脂,2006,31(3):71 - 74.

[4]張曉光,劉潔翔,范志金,等. 環(huán)糊精及其衍生物在農(nóng)藥領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,2009,11(3):291 - 297.

[5]Munsterman A S,Bertone A L,Zacho T A,etal. Effects of the omega - 3 fatty acid,Al - pha - linolenic acid on Lipopolysaccharide- challenged synovial explants from horses[J]. Am J Vet Res,2005,66(9):1503.

[6]Alexei M,Yuriy A,Abramov S,etal. Development of machine learning models of β - cyclodextrin and sulfobutylether - β - cyclodextrin complication free energies[J]. International Journal of Pharmaceutics,2011,418(2):207 - 216.

[7]丁璞,徐永苗,邱芳萍. β - 環(huán)糊精制備紫草提取物微膠囊的工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(2):184 - 188.

[8]孫素玲,萬永,張干偉,等. 海狗油皂化工藝的研究[J]. 食品科技,2007(2):155 - 158.

[9]何楨,張于軒. 多響應(yīng)實驗設(shè)計的優(yōu)化方法研究[J]. 工業(yè)工程,2005,6(4):35 - 38.

[10]Alexei M,Yuriy A,Abramov S,etal. Development of machine learning models of β - cyclodextrin and sulfobutylether - β- cyclodextrin complication free energies[J]. Int J Pharm,2011,418(2):207 - 216.