何慶玲，趙晨卉，王偉民，葛 文，李 雅，張 婧，王迎偉，邱 文*

1南京醫(yī)科大學免疫學系，江蘇 南京211166；2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 南京210029

肺癌（亦稱支氣管肺癌）是一種發(fā)生于支氣管黏膜上皮組織的惡性腫瘤，通常分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）兩大類［1］。由于絕大多數(shù)肺癌患者屬于NSCLC（約為85%），加上近年來NSCLC的發(fā)病率和病死率呈逐年升高的趨勢［2］，故深入探討NSCLC的病因和發(fā)病機制具有十分重要的意義。

NSCLC的形成不僅與遺傳和環(huán)境等因素有關［3］，而且還與腫瘤局部微環(huán)境中的某些促炎因子（如TNF-α和IL-6）和補體（如C3a和C5a）的作用明顯相關［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，補體C5a不僅可由補體系統(tǒng)3條途徑激活時產(chǎn)生，還可由腫瘤組織本身產(chǎn)生［6］。腫瘤局部微環(huán)境中的補體C5a通過其C5a受體（C5aR）作用于靶細胞，既能調節(jié)免疫應答，又能促進腫瘤的生長和轉移［7］。NSCLC患者血漿和癌組織中C5a含量明顯增多，并能促進NSCLC細胞的增殖［5］。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，體外用C5a刺激NSCLC細胞不僅能促進細胞的增殖還能增強細胞的遷移，但有關C5a促NSCLC細胞增殖和遷移的分子機制，目前尚不清楚。

據(jù)報道，C5a誘導靶細胞的生物學效應通常與靶細胞內某些信號通路的活化有關，例如C5a可激活絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt1、細胞外信號調節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）等［8-9］。已知，Akt1活化與多種腫瘤細胞的增殖和活化密切相關。Akt1可通過激活其下游分子如mTOR等促進腫瘤細胞的增殖、遷移以及腫瘤血管的形成［10］。此外，ERK1/2是MAPK家族中重要成員。作為高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，ERK1/2可識別并磷酸化特定的底物蛋白，在細胞的增殖與分化等活動中發(fā)揮重要作用［10］。文獻報道C5a可通過活化Akt1促進乳腺癌細胞的增殖［7］。此外，C5a還可通過激活ERK1/2增強腎癌細胞的增殖和侵襲能力［12］。但是，有關C5a作用于NSCLC細胞后信號通路的激活情況尚未見文獻報道。

本課題的前期研究已發(fā)現(xiàn)，用C5a刺激體外培養(yǎng)的NSCLC細胞后，NSCLC細胞的增殖和遷移能力均顯著提高，且Akt1和ERK1/2的磷酸化水平也同步上調，故推測C5a刺激NSCLC細胞后，可能通過激活Akt1或ERK1/2信號分子促進細胞的增殖和遷移。鑒于此，本課題開展了以下實驗，研究C5a激活Akt1和ERK1/2促進NSCLC細胞的增殖和遷移的作用與機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B和3種NSCLC細胞系（H1703、PC9、H1299）均由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。人C5a蛋白（R&D Systems公司，美國），抗C5aR抗體（武漢Abclonal公司），抗總Akt1（t-Akt1）、磷酸化Akt1（p-Akt1，Ser473）、總ERK1/2（t-ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2，Thr202/Tyr204）、總PKC-α（t-PKC-α）、磷酸化p-PKC-α（p-PKC-α，Thr638）的抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）。HRP標記山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（合肥Biosharp公司）。Perifosine（Akt1抑制劑）和U0126（ERK1/2抑制劑）（上海MCE公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Wisent公司，加拿大）。DMEM（Gbico公司，美國）。CCK-8試劑盒（上海MCE公司）。

1.2 方法

1.2.1 BEAS-2B、H1703、PC9和H1299細胞系的培養(yǎng)

將前述細胞系接種于含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。當細胞融合度達到90%時，按1∶3比例進行細胞傳代，并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 BEAS-2B、H1703、PC9和H1299細胞系C5aR表達的檢查

RT-PCR：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫找到目的基因CDS區(qū)，利用Premier 5軟件進行引物設計，并交由通用生物系統(tǒng)有限公司合成。序列如下：C5aR（上游5′-ACTACAGCCACGACAAACG-3′；下游5′-CCCTAACCACGGACTCTTC-3′），GAPDH（上游5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′；下 游5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′）。提取前述細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，以此cDNA為模板，用Prime STAR＠Max DNA Polymerase進行PCR反應，最終擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并拍照成像。

Western blot：將上述細胞裂解物離心3 min，取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，先用45 V恒壓濃縮，再用120 V電泳2 h，接著用0.3 A濕轉120 min，待蛋白轉印到PVDF膜上后再用脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入抗C5aR抗體4℃孵育過夜。漂洗后用HRP標記的二抗室溫孵育1 h，最后行ECL化學發(fā)光試劑檢測。

1.2.3 Western blot實 驗 檢測PC9細胞中Akt1、ERK1/2、PKC-α磷酸化水平

收集C5a刺激PC9細胞后不同時間點的細胞蛋白，行Western blot檢測Akt1、ERK1/2、PKC-α的表達和磷酸化水平，方法同前。用10 μmol/L Perifosine或U0126分別處理PC9細胞30 min，然后加入50 ng/mL C5a共同孵育3 h，行Western blot檢測Akt1和ERK1/2的表達和磷酸化。

1.2.4 CCK-8實驗檢測PC9細胞的增殖

將PC9細胞種植于96孔板，24 h后換成無血清DMEM培養(yǎng)24 h，接著用不同濃度的C5a刺激細胞48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37℃孵育40～50 min，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。同上將細胞接種至96孔板，分別用10 μmol/L Perifosine和U0126處理細胞30 min，再用50 ng/mL C5a刺激細胞48 h，開展CCK-8實驗檢測細胞增殖水平。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測PC9細胞的遷移

將PC9細胞接種于6孔板，24 h后換成無血清DMEM培養(yǎng)12 h。通過200 μL移液器吸頭產(chǎn)生細胞單層的線性傷口，用PBS清洗脫落的細胞，加入含1%FBS的DMEM，同時加入不同濃度的C5a繼續(xù)培養(yǎng)，并于24 h和48 h時觀察細胞的遷移情況。同上將細胞接種至6孔板，進行細胞劃痕，用10 μmol/L濃度的Perifosine和U0126分別處理細胞，30 min后再用50 ng/mL的C5a處理細胞24 h和48 h，觀察其遷移情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 NSCLC細胞系中C5aR的表達情況

首先檢測了正常支氣管上皮細胞（BEAS-2B）以及3種常見的NSCLC細胞系（H1703、PC9和H1299）中C5aR的表達情況。結果顯示，C5aR在PC9和H1703細胞中均有明顯的表達，但以PC9細胞的表達水平最高（圖1），故后續(xù)實驗選擇了PC9細胞系進行相關實驗。

圖1 正常支氣管上皮細胞BEAS-2B和NSCLC細胞系H1703、PC9和H1299中C5aR的表達情況Figure 1 The C5aR expression in the human normal bronchial epithelial cell line BEAS-2B and three NSCLC cell lines（H1703，PC9 and H1299）

2.2 C5a刺激PC9細胞后誘導細胞增殖和遷移及其刺激劑量的確定

2.2.1 不同濃度C5a刺激PC9細胞后細胞增殖能力的變化

在證實了PC9細胞高表達C5aR后，分別用0、0.05、0.50、5.00，50.00、500.00 ng/mL的C5a刺激PC9細胞，48 h后行CCK-8實驗檢測細胞的增殖情況。結果發(fā)現(xiàn)，PC9細胞的增殖隨著C5a刺激劑量的加大逐漸增強，當刺激劑量為50.00和500.00 ng/mL時，細胞增殖最為顯著（圖2）。

圖2 CCK-8實驗檢測C5a刺激PC9細胞的增殖情況Figure 2 C5a stimulates the proliferation of PC9 cells by CCK-8 experiment

2.2.2 不同濃度C5a刺激PC9細胞后細胞遷移能力的改變

分別用0、0.05、0.50、5.00、50.00、500.00 ng/mL C5a刺激PC9細胞48 h后，行劃痕實驗檢測細胞的遷移情況。結果顯示，C5a以劑量依賴性的方式促進細胞的遷移，其中以50.00和500.00 ng/mL劑量的效果最為顯著（圖3）。由于50.00 ng/mL和500.00 ng/mL C5a刺激劑量之間細胞增殖和遷移水平無顯著差異，故選擇用50.00 ng/mL劑量開展后續(xù)的實驗。

圖3 細胞劃痕實驗檢測C5a刺激PC9細胞的遷移情況Figure 3 C5a stimulates the migration of PC9 cells by cell scratch test

2.2.3 C5a促進PC9細胞Akt1和ERK1/2的磷酸化

為了探討C5a誘導PC9增殖和遷移的潛在機制，用C5a刺激PC9細胞，在不同時間點（0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h）檢測增殖和遷移相關的信號分子Akt1、ERK1/2和PKC-α的表達與磷酸化情況。結果顯示，C5a刺激PC9細胞后，顯著增強Akt1和ERK1/2的磷酸化水平，且其峰值在3 h左右，而PKC-α的表達和磷酸化均未見明顯變化（圖4）。

圖4 C5a刺激PC9細胞后Akt1、ERK1/2和PKC-α的表達與磷酸化情況Figure 4 The expression and phosphorylation of Akt1，ERK1/2 and PKC-α in PC9 cells treated with C5a

2.2.4 C5a通過Akt1-ERK1/2通路誘導PC9細胞增殖和遷移

進一步探討了Akt1和ERK1/2在C5a誘導PC9細胞增殖和遷移的作用。用Akt1抑制劑Perifosine和ERK1/2抑制劑U0126分別處理PC9細胞30 min（設DMSO溶劑對照），接著用C5a刺激3 h后，行Western blot檢測Akt1和ERK1/2的表達和磷酸化。結果顯示，Perifosine和U0126可分別阻斷Akt1和ERK1/2的磷酸化，且均不影響其蛋白表達。此外，Perifosine能 下 調ERK1/2的磷酸化，而U0126對Akt1的磷酸化沒有明顯影響（圖5），提示C5a刺激PC9細胞后Akt1和ERK1/2的活化可能存在一定的上下游關系，即C5a刺激PC9細胞后通過激活Akt1誘導ERK1/2的活化。CCK-8和細胞劃痕實驗進一步表明，抑制Akt1和ERK1/2可以顯著減弱C5a上調的PC9細胞增殖和遷移（圖6）。上述結果表明，C5a刺激PC9細胞后可通過激活Akt1-ERK1/2通路促進PC9細胞的增殖和遷移。

圖5 Akt1和ERK1/2抑制劑對C5a誘導PC9細胞中Akt1和ERK1/2表達和磷酸化的影響Figure 5 Effects of Akt1 and ERK1/2 inhibitors on the expression and phosphorylation of Akt1 and ERK1/2 in PC9 cells induced by C5a

圖6 Akt1和ERK1/2抑制劑對C5a誘導PC9細胞增殖和遷移的影響Figure 6 Effects of Akt1 and ERK1/2 inhibitors on the proliferation and migration of PC9 cells induced by C5a

3 討論

NSCLC是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤。在我國，NSCLC已成為發(fā)病率和死亡率均排在首位的惡性腫瘤［1］，但截至目前，有關NSCLC的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，其可能與NSCLC腫瘤微環(huán)境中的某些促炎因子或補體成分（如C5a）的上調有一定關系［3，12］。

已知C5a是補體系統(tǒng)通過3條途徑激活時形成的C5裂解片段。對于腫瘤生長而言，C5a既能作為趨化因子招募中性粒細胞和單核巨噬細胞等入侵腫瘤局部，釋放更多的促炎因子，又能作為刺激物直接誘導腫瘤細胞的增殖［4］。NSCLC患者體內可檢測到C5a水平顯著升高，且患者體內升高的C5a不僅與其補體系統(tǒng)的活化相關，而且還可來源于NSCLC細胞本身［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，體外用C5a刺激NSCLC細胞不僅能促進細胞的增殖，還能增強細胞的遷移，因此又進一步研究C5a刺激NSCLC細胞增殖和遷移可能涉及的分子機制。

眾所周知，腫瘤細胞的增殖和遷移與其胞內的信號通路的活化密切相關，但有關C5a刺激NSCLC細胞后能否開啟某些信號通路，目前尚不清楚。據(jù)此，本實驗用Western blot檢測了一些信號分子的磷酸化（即活化）情況。結果發(fā)現(xiàn)，C5a刺激PC9細胞后其Akt1和ERK1/2的磷酸化顯著增加。Akt1和ERK1/2抑制劑可明顯下調由C5a刺激PC9細胞后誘導的細胞增殖和遷移，提示Akt1和ERK1/2均參與調控C5a誘導PC9細胞的增殖和遷移作用。值得一提的是，文獻報道C5a也可作用于其他腫瘤細胞，并激活Akt1或ERK1/2。例如，Lu等［7］報道C5a可通過活化Akt1調控補體應答基因-32（complement response gene-32，RGC-32）基因的表達，促進乳腺癌細胞的增殖；Maeda等［12］研究發(fā)現(xiàn)，C5a在轉移性腎細胞癌中高表達，并可通過激活ERK1/2促進癌細胞的侵襲。由此可見，多種腫瘤組織的腫瘤微環(huán)境中C5a含量均顯著上調，上調的C5a可通過活化Akt1或ERK1/2促進腫瘤細胞的增殖和遷移。

已有文獻報道，生物堿Cyclovirobuxine D（CVB D）可以通過Akt1-ERK1/2信號通路抑制結直腸癌腫瘤發(fā)生［15］，但C5a活化Akt1或ERK1/2是否存在相互作用，目前尚不知曉。因此又開展相應的實驗，研究Akt1和ERK1/2之間是否存在上下游調控的關系。結果顯示，在受C5a刺激的PC9細胞中，Perifosine能同時下調Akt1和ERK1/2的磷酸化，而U0126僅能抑制ERK1/2磷酸化，卻對Akt1磷酸化水平?jīng)]有明顯的影響，提示C5a刺激PC9細胞后或許能通過激活Akt1誘導ERK1/2的活化。

綜上所述，本研究提示，C5a刺激NSCLC細胞后可能通過活化Akt1-ERK1/2通路促進NSCLC細胞的增殖和遷移，這為探究NSCLC的發(fā)病機制提供了新的思路和實驗根據(jù)。