匡 衡，蔡 欣，楊 展，周東明，周婷婷*，汪茂榮*，朱 進(jìn)

1東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)肝病科教研室，安徽醫(yī)科大學(xué)八一臨床學(xué)院，江蘇 南京210001；2東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京210002

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病，在過去數(shù)千年里造成了約2億人死亡。有記載的鼠疫大爆發(fā)約有3次，分別是查士丁尼瘟疫、黑死病和第3次鼠疫大爆發(fā)，均對人類產(chǎn)生了重要影響，其中第3次鼠疫大爆發(fā)起源于我國云南并持續(xù)至今［1］。

鼠疫耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌，同屬腸桿菌科耶爾森菌屬。鼠疫耶爾森菌有極快的繁殖速度和較強(qiáng)的侵襲性，感染者死亡率極高，其侵襲性的強(qiáng)弱與桿菌表面抗原有較大關(guān)系。F1蛋白是鼠疫桿菌莢膜抗原，由caf1操縱子編碼，鼠疫桿菌感染人體后，F(xiàn)1抗原形成了高分子量的聚合物，聚集在細(xì)菌表面［2］。F1抗原可與體內(nèi)紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及組織細(xì)胞黏附，直接損傷組織，且隨血液擴(kuò)散并大量繁殖［3-4］。

目前F1抗原主要用于制備亞單位疫苗，同時(shí)也可用于鼠疫鑒定。但鼠源性抗體極易被人體免疫系統(tǒng)所排斥，同時(shí)鼠源Fc片段難以激活人體免疫系統(tǒng)。人源抗體的Fc片段，可以與人體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的FcRn受體特異性結(jié)合，從而避免在體內(nèi)被迅速降解［5］，鼠源性抗體因?yàn)椴荒芘c其結(jié)合，在人體內(nèi)半衰期較短，限制了鼠源抗體的臨床應(yīng)用。蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室前期制備并獲得了穩(wěn)定表達(dá)抗鼠疫F1抗體的雜交瘤細(xì)胞株4C6，并完成了抗體的保護(hù)性試驗(yàn)［6］。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，制備抗鼠疫保護(hù)性抗原F1嵌合抗體，以期在臨床檢驗(yàn)和鼠疫治療中發(fā)揮作用。

1 材料和方法

1.1 材料

F1-4C6雜交瘤細(xì)胞及抗F1抗體由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室前期制備，TOP10感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），ProteinG純化柱（GE公司，美國），CHOMaxA培養(yǎng)基（上海邁邦生物有限公司），HRP標(biāo)記山羊抗人IgG二抗、Millipore超濾離心管（10 000 kDa）（Sigma公司，美國），限制性內(nèi)切酶NotⅠ和EcoRⅠ（NEB公司，美國），TMB顯色液及終止液（上海碧云天），ProteinG瓊脂糖珠、總RNA提取試劑盒（Thermo公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 人源化質(zhì)粒構(gòu)建

將生長良好的F1-4C6細(xì)胞消化裂解后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板分別擴(kuò)增F1抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，切膠回收后連接于pMD-18t載體上，并轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)挑取單克隆后測序，通過比對和分析，獲得抗F1抗體輕、重鏈可變區(qū)基因序列。將抗體的可變區(qū)序列人源抗體的恒定區(qū)基因序列拼接，序列優(yōu)化后全基因合成并克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒pMH3中，分別命名為pMH3-f1-k和pMH3-f1-h。

1.2.2 穩(wěn)定表達(dá)真核細(xì)胞系建立與篩選

取5×106個(gè)生長良好的CHO-S細(xì)胞與pMH3-f1-k和pMH3-f1-h兩種質(zhì)?；靹蚝蠹尤?.2 mm電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48 h后取培養(yǎng)液進(jìn)行斑點(diǎn)分子雜交法（Dot blot）檢測其表達(dá)。取100 μL上清，加入含50 ng F1抗原進(jìn)行ELISA檢測，37℃孵育1 h，用PBST溶液清洗3遍，隨后用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的抗人Fc段抗體孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline tween，PBST）溶液清洗5遍后，四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色液顯色5 min，觀察顯色情況。

使用終濃度為1 000 μg/mL G418培養(yǎng)液培養(yǎng)陽性細(xì)胞，2周后挑取單克隆于96孔板中培養(yǎng)，1周后做Dot blot檢測，分別從6個(gè)陽性孔中挑取110個(gè)細(xì)胞加入96孔板中培養(yǎng)，1周后挑取單克隆并做Dot blot檢測，挑選表達(dá)量最高的6株細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。

將6株細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)10代并凍存細(xì)胞，觀察生長情況并取上清進(jìn)行ELISA檢測，并測定每株細(xì)胞450 nm吸光度值，挑選一株生長迅速且蛋白表達(dá)量高的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)。

1.2.3 抗體表達(dá)與純化

對大量培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3×107個(gè)細(xì)胞加入30 mL CHOmaxA培養(yǎng)基中，在37℃條件下懸浮培養(yǎng)，每隔2 d檢測細(xì)胞密度，觀察細(xì)胞生長狀況，15 d后離心收集上清。將收集的上清經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，使用Protein G純化柱純化。濃縮后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液調(diào)整其濃度為1 mg/mL。取20 μL抗體加入帶有還原劑的加樣緩沖液，于100℃水浴鍋中水浴5 min，隨后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.4 抗體特性分析

1.2.4.1 間接ELISA檢測

每孔50 ng F1抗原包被酶標(biāo)板，將純化抗體從1∶200開始梯度倍比稀釋后加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h后洗滌3遍，加入HRP標(biāo)記二抗，繼續(xù)于37℃孵育1 h后洗滌3遍，用TMB顯色液顯色，測定D（450 nm）值。

1.2.4.2 競爭性ELISA檢測

50 ng/孔F1抗原包被酶標(biāo)板，以1∶2 000濃度加入抗F1抗體孵育1 h，洗滌后，將純化后的人源化F1嵌合抗體從1∶50開始倍比稀釋，加入酶標(biāo)板孵育1 h，PBST洗滌5遍，加入HRP標(biāo)記的抗人Fc段抗體孵育后顯色，測定D（450 nm）值。

1.2.4.3 親和力檢測

使用Biacore X100分析儀進(jìn)行親和力檢測。選取CM5芯片，并在芯片上固定F1抗體，將抗F1的嵌合抗體和抗F1鼠源抗體梯度稀釋后進(jìn)樣分析。使用Biacore X100軟件分別計(jì)算其親和力。

1.2.4.4 免疫沉淀

將抗F1抗原嵌合抗體與含有裂解液的F1抗原混合，于4℃下?lián)u床孵育過夜，加入Protein G瓊脂糖于4℃下?lián)u晃過夜。離心后取沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯染色后切割條帶做質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 抗F1抗體輕鏈、重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR獲得4C6雜交瘤細(xì)胞中抗F1輕、重鏈可變區(qū)基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小符合預(yù)期，輕鏈為300 bp左右，重鏈為350 bp左右（圖1），分別將輕、重鏈可變區(qū)基因片段克隆到pMD-18T載體中，并轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)并挑取單克隆測序。分別將抗F1抗體輕鏈、重鏈可變區(qū)基因與人源抗體恒定區(qū)基因拼接后，全基因合成并克隆進(jìn)pMH3質(zhì)粒中，質(zhì)粒雙酶切結(jié)果顯示輕鏈條帶為700 bp左右，重鏈條帶為1 400 bp左右，與設(shè)計(jì)條帶大小相符（圖2）。

圖1 PCR獲得輕重鏈條帶Figure 1 Light and heavy chain obtained by PCR

圖2 輕重鏈質(zhì)粒雙酶切條帶Figure 2 Light and heavy chain plasmid by double enzyme digestion

2.2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立與篩選

使用電穿孔技術(shù)，將輕、重鏈表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入CHO-S細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，取上清進(jìn)行Dot blot與ELISA檢測。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以表達(dá)抗F1嵌合抗體IgG，并與酶標(biāo)板包被的F1抗原結(jié)合（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液Dot blot檢測Figure 3 Dot blot detection of culture medium after transfection

使用G418篩選2周，將細(xì)胞挑取2次單克隆，取上清做Dot blot檢測，挑選目的蛋白表達(dá)量最高的6株單克隆細(xì)胞，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)10代，取上清進(jìn)行ELISA檢測，挑選表達(dá)蛋白量最高的一株命名為CHMIgG-F1C6-5，擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（圖4）。

圖4 6株細(xì)胞培養(yǎng)10代后培養(yǎng)液ELISA檢測Figure 4 Culture medium after 10 generations of 6 cell lines detected by ELISA

2.3 抗體表達(dá)與純化

將3×107個(gè)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于30 mL CHOmaxA培養(yǎng)基中，每2 d測定細(xì)胞密度。細(xì)胞培養(yǎng)15 d后，離心并收集上清進(jìn)行Dot blot與ELISA檢測均為陽性，結(jié)果提示，CHMIgG-F14C6-5細(xì)胞可以于懸浮培養(yǎng)基中穩(wěn)定表達(dá)抗F1嵌合抗體。

上清經(jīng)ProteinG親和純化后，得到抗F1嵌合抗體，加入PBS溶液調(diào)整濃度為1 mg/mL。經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳檢測，顯示抗體輕、重鏈大小符合預(yù)期，且濃度較高（圖5）。

2.4 抗體分析

2.4.1 間接ELISA檢測

將抗體從1∶200稀釋度開始稀釋，加入含F(xiàn)1抗原的酶標(biāo)板中進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果顯示，抗體稀釋度在1∶400以上時(shí)，D（450 nm）值與抗體濃度呈正相關(guān)，結(jié)果提示，嵌合抗體與F1抗原特異性結(jié)合，D（450 nm）值與抗體濃度呈正相關(guān)（圖6）。

圖6 抗體間接ELISA檢測Figure 6 Indirect ELISA detection of antibodies

2.4.2 競爭性ELISA

將抗F1鼠源抗體加入帶有F1抗原的酶標(biāo)板中，隨后加入人源化的嵌合抗體與其競爭結(jié)合F1抗原。當(dāng)嵌合抗體稀釋度為1∶50時(shí)，D（450 nm）值接近間接ELISA實(shí)驗(yàn)中嵌合抗體飽和時(shí)D（450 nm）值（圖7）。該結(jié)果提示，當(dāng)嵌合抗體稀釋度為1∶50時(shí)，酶標(biāo)板上F1結(jié)合位點(diǎn)大部分結(jié)合嵌合抗體。隨著嵌合抗體的濃度逐漸降低，D（450 nm）值也隨之不斷減小。該實(shí)驗(yàn)證明，抗F1嵌合抗體能夠與鼠源抗體競爭結(jié)合F1抗原上的相同表位。

圖7 嵌合抗體與鼠源抗體競爭性ELISA檢測Figure 7 Competitive ELISA detection of human chimeric antibody and mouse antibody

2.4.3 親和力檢測

兩種抗體進(jìn)樣后分析其親和力，嵌合抗體及鼠源抗體的平衡解離常數(shù)KD值分別為2.303×10-9mol/L與1.830×10-9mol/L，兩種抗體與F1抗原均有較高的親和力（圖8、9）。

圖8 Biacore T100檢測抗F1嵌合抗體親和力Figure 8 Biacore T100 assay results of human F1 antibody affinity

2.4.4 免疫共沉淀與質(zhì)譜分析

免疫共沉淀后的樣本，經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后，于15 kDa左右發(fā)現(xiàn)目的條帶（圖10），其大小與F1抗原一致，切膠回收后進(jìn)行質(zhì)譜分析，該蛋白為鼠疫F1抗原（圖11）。

圖10 嵌合抗體IP檢測Figure 10 Immunoprecipitation analysis of chimeric antibody

圖11 嵌合抗體質(zhì)譜分析Figure 11 Mass spectrometry analysis of chimeric antibodies

3 討論

圖9 Biacore T100檢測鼠源抗F1抗體親和力Figure 9 Biacore T100 assay results of mouse F1 antibody affinity

人源化抗體常分為嵌合抗體、表面重塑抗體及改型抗體3類，其中嵌合抗體是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)出嵌合抗體［7-8］。表面重塑抗體改變的氨基酸不多，人源化不徹底，在應(yīng)用上具有安全隱患，而改型抗體改變了抗體FR區(qū)基因，會(huì)降低抗體親和度，影響抗體效果［9］。

本研究采用制備嵌合抗體的技術(shù)方法，成功獲得了抗F1嵌合抗體，該抗體與F1抗原親和力較強(qiáng)，但嵌合抗體仍保留較長鼠源基因序列，導(dǎo)致抗體在人體內(nèi)療效不確定，安全性和實(shí)用性有待觀察。

CHO-S是一種常于生物制藥的懸浮細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有生長迅速，轉(zhuǎn)染效率高，極少分泌內(nèi)源蛋白，產(chǎn)物蛋白分泌于胞外，又免去了細(xì)胞破碎這一步驟，可以有效減少雜質(zhì)蛋白對抗體的污染，是目前實(shí)驗(yàn)室中最適合生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞系之一［10］。本研究使用化學(xué)成分確定的3種培養(yǎng)基CHO MaxA、CHOMaxFA、CHO MaxFB懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞，此3種培養(yǎng)基不含雜質(zhì)蛋白，有效抑制了Protein G柱純化過程中雜質(zhì)蛋白的產(chǎn)生［11］，從而實(shí)現(xiàn)抗體高表達(dá)，同時(shí)也利于精簡抗體純化步驟，縮減抗體生產(chǎn)成本，有利于大量生產(chǎn)。而同樣被廣泛應(yīng)用于抗體生產(chǎn)的大腸桿菌系統(tǒng)，由于其極易產(chǎn)生內(nèi)毒素和包涵體的原因，未被本課題采用。

鼠疫的臨床治療通常以鏈霉素聯(lián)用其他類型抗生素為主。在預(yù)防鼠疫方面，滅活疫苗已投入臨床應(yīng)用近百年，盡管近年來已研制出亞單位疫苗及DNA疫苗，但有待臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其安全性及有效性。近年來發(fā)現(xiàn)多種耐藥鼠疫桿菌，單純的藥物治療效果不明顯［12-14］，隨著恐怖主義勢力抬頭，耐藥鼠疫桿菌被應(yīng)用于生化武器研發(fā)，高效鼠疫治療方案的開發(fā)被提上日程。本研究制備的抗F1嵌合抗體可以與F1抗原特異性結(jié)合，可有效應(yīng)用于鼠疫檢測與治療。在后續(xù)研究中，需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)，分析其安全性及保護(hù)效率，為人源化中和抗體應(yīng)用于鼠疫臨床救治奠定基礎(chǔ)。