吳垚磊 李仰真 王 娜 馬 騰 趙玉柱 陳松林

半滑舌鰨酪氨酸酶基因()和多巴色素異構(gòu)酶基因()的克隆表達(dá)與分析*

吳垚磊1,2李仰真1,2王 娜1馬 騰1,2趙玉柱1,2陳松林1①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306)

作為我國(guó)鲆鰨魚(yú)類中的一種主要養(yǎng)殖品種，半滑舌鰨()有時(shí)會(huì)發(fā)生無(wú)眼側(cè)黑化(Melanism)、有眼側(cè)白化(Albinism)的體色異?，F(xiàn)象。本研究克隆了半滑舌鰨體色相關(guān)的酪氨酸酶基因()和多巴色素異構(gòu)酶基因()的cDNA序列，并對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和時(shí)空表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)獲得了基因編碼區(qū)cDNA序列長(zhǎng)度為1620 bp，編碼539個(gè)氨基酸；基因編碼區(qū)cDNA序列長(zhǎng)度為1551 bp，編碼516個(gè)氨基酸。結(jié)果顯示，和在20日齡前的魚(yú)苗體內(nèi)表達(dá)量較高，尤其是在變態(tài)關(guān)鍵時(shí)期(15～20日齡)表達(dá)量最高，30日齡時(shí)的表達(dá)量銳減到很低水平；在其他時(shí)期的皮膚組織中，這2個(gè)基因在有眼側(cè)正常皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚的表達(dá)量最高，在有眼側(cè)白化皮膚和無(wú)眼側(cè)正常皮膚中表達(dá)量極低；在其他時(shí)期的其他組織中，在眼睛中的表達(dá)量最高，其次是肝臟，在脾臟和肌肉中表達(dá)量極低。研究表明，和基因是半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化發(fā)生和有眼側(cè)體色維持的關(guān)鍵基因。本研究為查明半滑舌鰨體色異常機(jī)制提供了重要依據(jù)和參考。

半滑舌鰨；體色；酪氨酸酶基因()；多巴色素異構(gòu)酶基因()

半滑舌鰨()是我國(guó)特有的珍貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，年產(chǎn)量達(dá)10 000 t以上(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)局, 2019)。近年來(lái)，在人工育苗及養(yǎng)殖條件下，苗種經(jīng)常出現(xiàn)體色異?，F(xiàn)象，主要表現(xiàn)為有眼側(cè)白化(即有眼側(cè)原本的黑色素細(xì)胞無(wú)法正常合成黑色素，正常情況下有眼側(cè)為黃或金黃色)和無(wú)眼側(cè)黑化(即無(wú)眼側(cè)黑色素細(xì)胞大量異常聚集，正常情況下無(wú)眼側(cè)為白色) (李仰真等, 2014)，對(duì)其經(jīng)濟(jì)效益造成嚴(yán)重影響。

鲆鰨類具有與眾不同的體色分布，這與其獨(dú)特的變態(tài)發(fā)育過(guò)程有關(guān)。鲆鰨類的體色發(fā)生過(guò)程分為2個(gè)階段：第1階段，從出膜到其變態(tài)發(fā)育之前，黑色素細(xì)胞呈對(duì)稱性分布，主要位于身體的兩側(cè)；第2階段，眼睛向一側(cè)移動(dòng)，體型呈側(cè)扁型，到變態(tài)發(fā)育完成，由體色對(duì)稱轉(zhuǎn)變成黑色素在有眼側(cè)集中沉著，而無(wú)眼側(cè)幾乎無(wú)黑色素沉著(Burton, 1988)。

研究表明，酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)基因與人類疾病以及動(dòng)物的體色具有密切關(guān)系。在黑色素的合成中，TYR是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其C端有2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(與催化活性相關(guān))，是一種雙核銅結(jié)合蛋白；其N端具有負(fù)責(zé)將合成的序列轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)一步加工的信號(hào)肽(徐偉等, 2017)。

多巴色素異構(gòu)酶(dopachrome tautomerase, DCT)是黑色素合成中的限速酶，具有包括TYR、DCT、TYRP1在內(nèi)的酪氨酸酶家族相似的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)(王亞琪等, 2019)。DCT在黑色素細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，使酪氨酸酶的催化作用處于較優(yōu)狀態(tài)。當(dāng)其表達(dá)水平發(fā)生變化時(shí)，體內(nèi)的黑色素含量也會(huì)發(fā)生變化(孫學(xué)亮等, 2018)。王亞琪等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，基因還調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，決定著細(xì)胞的存活狀態(tài)。

目前，鮮見(jiàn)海水魚(yú)體色發(fā)育不同時(shí)期、的表達(dá)差異分析研究。近年來(lái)，研究人員對(duì)半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)視黃酸受體(宋雪松, 2018)、阿黑皮素原(POMC) (朱學(xué)武, 2016)、黑色素富集激素(MCH)及其受體等(徐永江等, 2017; 史學(xué)營(yíng)等, 2017)在半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且在此過(guò)程中，半滑舌鰨鱗片的組織學(xué)形態(tài)及相關(guān)調(diào)控過(guò)程也發(fā)生顯著變化。本研究通過(guò)克隆半滑舌鰨、基因，并通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行定量表達(dá)分析，探討這2個(gè)基因表達(dá)量與半滑舌鰨體色變化的關(guān)系，旨在了解體色變化的分子基礎(chǔ)，為魚(yú)類體色相關(guān)研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 半滑舌鰨取自河北省唐山市維卓水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。對(duì)親魚(yú)暫養(yǎng)、誘導(dǎo)性成熟，并對(duì)其人工授精。待受精卵充分發(fā)育、仔魚(yú)順利出膜，分別取出膜1、5、10、15、20和30 d的樣品若干。待其生長(zhǎng)至3月齡時(shí)，取半滑舌鰨有眼側(cè)黑色皮膚(正常)、有眼側(cè)白化皮膚、無(wú)眼側(cè)白色皮膚(正常)和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚樣本；取6月齡和12月齡半滑舌鰨有眼側(cè)黑色皮膚(正常)、有眼側(cè)白化皮膚、無(wú)眼側(cè)白色皮膚(正常)、無(wú)眼側(cè)黑化皮膚、肝、脾、眼、肌肉樣本。以上樣品置于RNA保存液(RNAwait，北京索萊寶科技有限公司)，過(guò)夜后放入–20℃冰箱中保存，備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RNA提取使用TRIZol reagent (TaKaRa)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為PrimeScript RT reagent kit with a gDNA eraser (TaKaRa)。PCR擴(kuò)增試劑為2×PCR MasterMix、DNA Marker DL 2000，膠回收試劑盒為TIANgelTM膠回收試劑盒(以上均為天根生化)，熒光定量表達(dá)使用SYBR Premix Ex? (TaKaRa)。連接轉(zhuǎn)化使用pMD18-T Vector、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(上海天根生物)、RNaseA-free ddH2O、100 mg/mL氨芐(Amp)、LB液體培養(yǎng)基、固體抗Amp LB培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 采集上述不同發(fā)育階段的稚魚(yú)以及3月齡幼魚(yú)的不同皮膚組織；取6、12月齡魚(yú)的4種不同皮膚組織、眼、肝臟、脾臟、肌肉，使用TRIZol法提取組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，并通過(guò)NanoVue? Plus分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及260 nm/280 nm值，–80℃保存。

提取半滑舌鰨不同發(fā)育階段的稚魚(yú)樣本，3月齡幼魚(yú)的4種不同皮膚組織以及6月齡和12月齡個(gè)體的有眼側(cè)正常皮膚、有眼側(cè)白化皮膚、無(wú)眼側(cè)正常皮膚、無(wú)眼側(cè)黑化皮膚、眼、肝臟、脾臟和肌肉共8個(gè)組織的RNA，通過(guò)PrimeScript RT reagent kit with a gDNA eraser (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA。

1.2.2、基因cDNA的克隆和序列測(cè)定 在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索半滑舌鰨和基因的預(yù)測(cè)序列。確定、基因的保守區(qū)，用Primer 5.0在保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物(表1)?；騊CR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，之后40個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，72℃ 7 min，最后4℃保存；基因PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，之后40個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，72℃ 7 min，最后4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用TIANgelTM膠回收試劑盒(北京天根生化)對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收，連接至pMD19-T1載體(TaKaRa, 日本)上，轉(zhuǎn)化到T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑取其中的陽(yáng)性克隆，送至睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析 經(jīng)過(guò)BioEdit比對(duì)和NCBI在線BLAST程序，檢測(cè)所得序列的準(zhǔn)確性，并得到、基因cDNA序列，通過(guò)NCBI搜索、基因的同源序列，并使用Blastx程序檢索蛋白相似性；運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件推導(dǎo)編碼的氨基酸序列及蛋白分子量，通過(guò)SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)蛋白的信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，并將半滑舌鰨和GenBank中其他物種的TYR、DCT蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析；通過(guò)MEGA-X軟件，以鄰接法Neighbor-Joining (NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Saitou, 1987)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 以測(cè)得的半滑舌鰨、基因序列為模板，設(shè)計(jì)定量引物(表1)，同時(shí)，將半滑舌鰨的β-Actin基因作為、基因的內(nèi)參基因，合成其特異性引物(表1)。使用SYBR Premix Ex?(TaKaRa)試劑盒，以得到的cDNA為模板，濃度為100 ng/μL，在ABI 7500 SDS儀(美國(guó)應(yīng)用生物公司)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用兩步法，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃ 30 s，72℃ 30 s，熔解曲線溫度為55℃～95℃。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，使用2?ΔΔCt法計(jì)算、基因的相對(duì)表達(dá)量。用Origin 7.5軟件作圖，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。通過(guò)檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性比較，<0.05表示差異顯著。

表1 半滑舌鰨TYR基因克隆使用的PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 TYR、DCT基因cDNA和編碼蛋白序列分析

利用RT-PCR技術(shù)成功獲得基因完整編碼序列。半滑舌鰨基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)為1620 bp，共編碼539個(gè)氨基酸，其編碼的TYR蛋白預(yù)測(cè)分子量為61.008 kDa，分析見(jiàn)圖1。

利用RT-PCR成功獲得基因完整編碼序列。基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?551 bp，編碼516個(gè)氨基酸，DCT蛋白預(yù)測(cè)分子量為57.948 kDa (圖2)。

2.2 同源性比較與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

通過(guò)NCBI的Blastp程序，搜索TYR同源蛋白氨基酸序列，選取了大刺鰍(: XP_026189265.1)、斑馬魚(yú)(: AMO00812.1)、青鳉(: BAA06155.1)、尼羅羅非魚(yú)(: XP_003441635.1)、黃金鱸(: XP_028429419.1)、綠頭鴨(: XP_005029640.2)、小鼠(: BAX25613.1)、人(: AAA61242.1)等16種有代表性的物種并確定相似性(表2)，通過(guò)MEGA-X進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨TYR與鱸形目、頜針魚(yú)目等魚(yú)類為同一分支，而爬行類、哺乳類等構(gòu)成另外獨(dú)立的分支。

NCBI網(wǎng)站搜索DCT同源蛋白氨基酸序列，選取斑馬魚(yú)(: AAJ64222.1)、劍尾魚(yú)(: XP_032423860.1)、鯽魚(yú)(: XP_026126897.1)、紅鰭東方鲀(: XP_003961932.1)、褐牙鲆(: XP_019945763.1)、雉雞(: XP_031466474.1)、歐亞野豬(: BAF48040.1)等19種有代表性的物種，確定相似性(表3)，并通過(guò)MEGA-X進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖4)。

結(jié)果表明，半滑舌鰨DCT與鲀形目、鳉形目、鯡形目、鯉形目等其他魚(yú)類形成獨(dú)立的分支，而兩棲、爬行和哺乳類形成另外的分支(圖4)。

2.3 TYR、DCT基因表達(dá)差異分析

2.3.1、基因在半滑舌鰨早期發(fā)育階段以及皮膚組織中的轉(zhuǎn)錄水平 在稚魚(yú)發(fā)育不同時(shí)期的qRT-PCR結(jié)果顯示(圖3)，從出膜后1～20 d的仔魚(yú)組織中，的表達(dá)總體上呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，尤其是在變態(tài)關(guān)鍵時(shí)期(15～20日齡)表達(dá)量最高，30日齡時(shí)表達(dá)量銳減到很低水平。3個(gè)時(shí)期基因的實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示(圖5)，在半滑舌鰨各皮膚組織中，有眼側(cè)黑色(正常)皮膚基因的表達(dá)量隨時(shí)間變化具有顯著差異(<0.05)，從3月齡、6月齡到12月齡，該基因表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)，而在有眼側(cè)白化、無(wú)眼側(cè)白色(正常)和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚中隨時(shí)間變化差異不顯著(>0.05)；同一時(shí)期，4種皮膚組織基因的表達(dá)均存在顯著差異(<0.05)，黑色皮膚中該基因的表達(dá)顯著高于有眼側(cè)白化、無(wú)眼側(cè)白色(正常)皮膚，而黑色皮膚之間和白色皮膚之間基因的表達(dá)均無(wú)顯著差異(>0.05) (圖6)。

圖1 半滑舌鰨TYR基因ORF序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 半滑舌鰨DCT基因ORF序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

表2 半滑舌鰨TYR氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的同源性比較

圖3 TYR氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)基因在不同時(shí)期仔魚(yú)及成魚(yú)皮膚組織中的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果顯示，從出膜后1～20 d的仔魚(yú)組織中，的表達(dá)總體上呈遞增趨勢(shì)，尤其在變態(tài)關(guān)鍵時(shí)期(15～20日齡)表達(dá)量最高，30日齡時(shí)表達(dá)量銳減到很低水平?；蛟诓煌l(fā)育時(shí)期的仔魚(yú)體內(nèi)的qRT-PCR結(jié)果顯示(圖7)，在半滑舌鰨各皮膚組織中，有眼側(cè)黑色(正常)皮膚、無(wú)眼側(cè)黑化皮膚和無(wú)眼側(cè)白色(正常)皮膚基因的表達(dá)隨時(shí)間變化顯著遞增(<0.05)，而在有眼側(cè)白化皮膚中隨時(shí)間變化差異不顯著(>0.05)；同一時(shí)期，4種皮膚中基因表達(dá)均存在顯著差異(<0.05)，黑色皮膚中該基因的表達(dá)顯著高于白色皮膚(<0.05)，而黑色皮膚之間和白色皮膚之間的基因表達(dá)均無(wú)顯著差異(>0.05) (圖8)。

表3 半滑舌鰨DCT氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的同源性比較

圖4 DCT氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

圖5 半滑舌鰨TYR早期生長(zhǎng)發(fā)育階段相對(duì)定量表達(dá)

圖6 半滑舌鰨TYR皮膚組織相對(duì)定量表達(dá)

圖7 半滑舌鰨DCT在仔魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育階段相對(duì)定量表達(dá)

圖8 半滑舌鰨DCT皮膚組織相對(duì)定量表達(dá)

2.3.2 不同組織中、基因的表達(dá)差異 半滑舌鰨的6月齡和12月齡，基因在不同組織中的表達(dá)情況如圖9、圖10所示。在6月齡成魚(yú)中，表達(dá)量在眼睛中最高，表達(dá)最高為眼部組織；另外，有眼側(cè)黑色皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚表達(dá)量也相對(duì)較高；同時(shí)，肝臟組織也具有較高的表達(dá)量，在脾臟中極低表達(dá)，在有眼側(cè)白化皮膚、無(wú)眼側(cè)正常(白色)皮膚和肌肉中幾乎不表達(dá)。在12月齡半滑舌鰨中，在眼睛中表達(dá)最高，但顯著低于6月齡，其有眼側(cè)正常皮膚(黑色)、無(wú)眼側(cè)黑化皮膚的表達(dá)較高，脾臟、肝臟中的表達(dá)極低，無(wú)眼側(cè)正常皮膚(白色)和肌肉中僅微量表達(dá)或幾乎不表達(dá)。

在6月齡半滑舌鰨中，表達(dá)在眼睛中最高，肝臟中也有較高的表達(dá)量；另外，有眼側(cè)黑色皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚表達(dá)量相對(duì)較少，有眼側(cè)白化和無(wú)眼側(cè)正常皮膚、脾臟、肌肉幾乎不表達(dá)。在12月齡半滑舌鰨中，在眼睛中表達(dá)最高，但稍低于6月齡的表達(dá)量，肝臟、有眼側(cè)正常皮膚(黑色)、無(wú)眼側(cè)黑化皮膚中有較高表達(dá)，在無(wú)眼側(cè)正常皮膚(白色)、脾臟和肌肉中幾乎不表達(dá)。

圖9 半滑舌鰨TYR在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

圖10 半滑舌鰨DCT在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

3.1 序列分析

本研究利用qRT-PCR技術(shù)，獲得了半滑舌鰨的基因的編碼區(qū)序列，其CDS序列由539個(gè)氨基酸構(gòu)成，編碼的TYR蛋白預(yù)測(cè)分子量為61.008 kDa，其蛋白N端具有由19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，具有指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的作用；中間有由236個(gè)氨基酸組成的功能性結(jié)構(gòu)域，與該蛋白執(zhí)行黑色素合成的生理功能密切相關(guān)。氨基酸同源性分析顯示，半滑舌鰨TYR與其他魚(yú)類的同源性高達(dá)80%～85%，與爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物存在50%以上的同源性。

基因作為一種酪氨酸酶基因，其表達(dá)能夠影響酪氨酸酶的活性以及黑色素合成的效率。本研究通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得了半滑舌鰨基因的編碼區(qū)序列，該基因蛋白序列由516個(gè)氨基酸組成，DCT蛋白預(yù)測(cè)分子量為57.948 kDa，蛋白N端有由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，具有指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的作用；中間有由231個(gè)氨基酸組成的功能性結(jié)構(gòu)域，與該蛋白執(zhí)行黑色素合成與沉著的生理功能密切相關(guān)。氨基酸同源分析顯示，半滑舌鰨DCT與其他硬骨魚(yú)類有高達(dá)77.33%～88.05%的同源性，與爬行類、鳥(niǎo)類以及哺乳類存在50%以上的同源性。

3.2 時(shí)空表達(dá)差異分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了仔魚(yú)、基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，從出膜后1～20 d的仔魚(yú)組織中，、的表達(dá)總體上呈遞增趨勢(shì)，表明、基因在半滑舌鰨變態(tài)發(fā)育過(guò)程中顯著上調(diào)。

對(duì)半滑舌鰨不同生長(zhǎng)時(shí)期的皮膚組織進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因在有眼側(cè)白化皮膚和無(wú)眼側(cè)白色皮膚(正常)中表達(dá)極低，且隨時(shí)期變化無(wú)顯著差異；該基因在有眼側(cè)黑色(正常)皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚的表達(dá)量差異不大，但隨著時(shí)期變化存在遞增趨勢(shì)，表達(dá)量為白色皮膚組織的20倍以上。Pomerantz等(1975)和Iwata等(1990)先后發(fā)現(xiàn)基因在人體黑色皮膚組織中活性顯著高于非黑色皮膚組織，這與本研究的結(jié)果基本一致。

基因在同時(shí)期半滑舌鰨有眼側(cè)白化和無(wú)眼側(cè)白色(正常)皮膚中表達(dá)較低，無(wú)眼側(cè)白色(正常)皮膚隨時(shí)間變化存在遞增趨勢(shì)，有眼側(cè)白化皮膚隨時(shí)間變化無(wú)顯著差異；該基因在有眼側(cè)黑色(正常)皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚的表達(dá)差異不大，均隨時(shí)間變化有遞增趨勢(shì)，表達(dá)量為白色皮膚的4倍以上。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)色素細(xì)胞分析顯示，黑色素細(xì)胞中基因的表達(dá)顯著高于其他色素細(xì)胞(Higdon, 2013)；基因在鯽() (Zhu, 2016)和莫桑比克羅非魚(yú)() (Zhang, 2017)黑色皮膚中的表達(dá)顯著高于非黑色皮膚，與本研究的結(jié)果相一致。

對(duì)半滑舌鰨其他組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因在半滑舌鰨眼睛中的表達(dá)量極高，為肝臟表達(dá)量的16倍以上；其次為肝臟和脾臟，肌肉中的表達(dá)量極低，且均隨時(shí)間變化無(wú)顯著差異。基因在同一時(shí)期半滑舌鰨的眼睛中表達(dá)最高，約為肝臟表達(dá)量的10倍，且隨時(shí)間變化有遞減趨勢(shì)；該基因在脾臟和肌肉中的表達(dá)量較低，尤其是肌肉中的表達(dá)可忽略不計(jì)。以上差異表明，、都與半滑舌鰨黑色素發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)，但生理功能存在一定的差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，該過(guò)程在眼睛中較黑色皮膚更為活躍。由此可以推測(cè)，黑色素對(duì)于鲆鰨魚(yú)類眼色和視覺(jué)具有更重要的作用，這有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行充分驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合PCR技術(shù)和GenBank序列比對(duì)，獲得半滑舌鰨酪氨酸酶相關(guān)基因和的編碼區(qū)cDNA序列，分析了其分子結(jié)構(gòu)、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化特性，通過(guò)定量方式研究了在組織中的表達(dá)特性。和基因在脊椎動(dòng)物中具有進(jìn)化保守性，均與爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物存在50%以上的同源性，與其他魚(yú)類存在高達(dá)70%以上的同源性。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)闡明了半滑舌鰨出膜后不同時(shí)期和不同組織中的、基因表達(dá)特性，并分析了其與半滑舌鰨體色異常的關(guān)系，本研究為揭示半滑舌鰨體色異常機(jī)制提供了重要依據(jù)和參考。

BURTON D. Melanophore comparisons in different forms of ambicoloration in the flatfishand. Journal of Zoology, 1988, 214(2): 353–360

Fisheries and Fisheries Administration, Ministry of Agriculture and Rural Affairs. Chinese Fishery Statistics Yearbook. Beijing: Agricultural Press, 2019, 5–22 [農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局. 中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 2019, 5–22]

HIGDON C W, MITRA R D, JOHNSON S L. Gene expression analysis of zebrafish melanocytes, iridophores, and retinal pigmented epithelium reveals indicators of biological function and developmental origin. PLoS One, 2013, 8(7): e67801

IWATA M, CORN T, IWATA S,. The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins. Society for Investigative Dermatology, 1990, 95(1): 9–15

LI Y Z, CHEN S L, XING H F,. The preliminary study of albinism in. Journal of Fisheries of China, 2014, 38(1): 76–83 [李仰真, 陳松林, 邢賀飛, 等. 半滑舌鰨白化現(xiàn)象的初步研究. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 38(1): 76–83]

POMERANTZ S H, ANCES I G. Tyrosinase activity in human skin influence of race and age in newborns. Journal of Clinical Investigation, 1975, 55(5): 1127–1131

SAITOU N, NEI M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406–425

SHI X Y, LIU X Z, SHI Y,. Molecular characterization ofand its corelation with blind-side hypermelanosis in. Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(1): 91–102 [史學(xué)營(yíng), 柳學(xué)周, 石瑩, 等. 半滑舌鰨()黑色素聚集素受體()表達(dá)特性及其與無(wú)眼側(cè)黑化的關(guān)系. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2017, 38(1): 91–102]

SONG X S. Cloning, expression patterns and physiological roles of two retinoic acid receptors in blind side hypermelanosis in. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2018 [宋雪松. 半滑舌鰨視黃酸受體克隆及其對(duì)無(wú)眼側(cè)黑化的調(diào)控作用研究. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2018]

SUN X L, GAO W W, SHI H Y,. Design and evaluation of primers for analysis ofgene expression in blood parrot ()by using real-time fluorescence quantitative PCR technique. Tianjin Agricultural Sciences, 2018, 24(12): 46–50 [孫學(xué)亮, 高微微, 石洪玥, 等. 血鸚鵡基因表達(dá)qPCR分析的引物設(shè)計(jì)與評(píng)估. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 24(12): 46–50]

WANG Y Q, HU L L, WANG R N,. Advances in research on animal coat color candidate gene dopachrome- tautomerase (). Journal of Hebei Normal University of Science and Technology, 2019, 33(1): 54–57 [王亞琪, 胡露露, 王瑞寧, 等. 動(dòng)物毛色候選基因的研究進(jìn)展. 河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2019, 33(1): 54–57]

XU W, FENG J Q, HUANG L,. Research progress ongene. China Animal Husbandry Journal, 2017, 53(4): 23–26 [徐偉, 封竣淇, 黃蘭, 等.基因研究進(jìn)展. 中國(guó)畜牧雜志, 2017, 53(4): 23–26]

XU Y J, ZHU X W, LIU X Z,. Cloning and expression of melanin-concentrating hormone in half-smooth tongue sole (). Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(1): 81–90 [徐永江, 朱學(xué)武, 柳學(xué)周, 等. 半滑舌鰨()黑色素富集激素基因的克隆和表達(dá). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2017, 38(1): 81–90]

ZHANG Y, LIU J, FU W,. Comparative transcriptome and DNA methylation analyses of the molecular mechanisms underlying skin color variations in Crucian carp (L.). BMC Genetics, 2017, 18(1): 95

ZHU W, WANG L, DONG Z,. Comparative transcriptome analysis identifies candidate genes related to skin color differentiation in red tilapia. Scientific Reports, 2016, 6: 31347

ZHU X W. Studies on regulation mechanisms underlie blind-side hypermelanosis of farmed flatfish. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2016 [朱學(xué)武. 養(yǎng)殖鲆鰈類無(wú)眼側(cè)黑化調(diào)控機(jī)制研究. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2016]

Expression Analysis ofandGenes Related to Body Color inat Different Periods and in Different Tissues

WU Yaolei1,2, LI Yangzhen1,2, WANG Na1, MA Teng1,2, ZHAO Yuzhu1,2, CHEN Songlin1①

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China;2. National Experimental Teaching Demonstration Center of Aquatic Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Melanin commonly exists in animal tissues. The animal body surface has different colors and abundant pigment patterns due to differences in the distribution and development of melanin and related cells. Different pigment patterns have important functions such as biological camouflage, courtship, etc., especially in fish., one of the dominant aquaculture flatfish species in China, often suffers from two body color anomalies, i.e. melanism and albinism, which have hindered the development of high-quality seeds and aquaculture. In this study, cDNA sequences of two color-related genes (.and) were cloned and phylogenetically analyzed. Further, expression levels of both genes were analyzed in different stages and in different tissues. The cDNA sequence length ofgene coding region is 1620 bp, encoding 539 amino acids. The length of the cDNA sequence in the coding region ofgene is 1551 bp, encoding 516 amino acids. In this study, it was found that the expression levels ofandwere high in fry that were less than 20-day-old, especially during the critical period of metamorphosis (15 to 20-day-old), and decreased to a very low level at 30-day-old. In other skin tissues, the expression levels of these two genes were highest in normal skin on the ocular side and in dark skin on the blind side, and extremely low in albino skin on the ocular side and in normal skin on the blind side. Among other tissues at other times, the highest expression was in the eye, followed by the liver, with very low expression in the spleen and muscles. Results show thatandgenes are the key genes for blind-side melanogenesis and ocular-side color maintenance in. This study provides an important basis and reference for identifying the mechanism of color anomaly in.

; Body color; Tyrosinase gene (); Dopa isomerase gene ()

CHEN Songlin, E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0042-11

10.19663/j.issn2095-9869.20200516001

http://www.yykxjz.cn/

吳垚磊, 李仰真, 王娜, 馬騰, 趙玉柱, 陳松林. 半滑舌鰨酪氨酸酶基因()和多巴色素異構(gòu)酶基因()的克隆表達(dá)與分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 42–52

WU Y L, LI Y Z, WANG N, MA T, ZHAO Y Z, CHEN S L. Expression analysis ofandgenes related to body color inat different periods and in different tissues. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 42–52

陳松林，研究員，E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

2020-05-16,

2020-05-29

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31702333)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47-G03)和山東省泰山學(xué)者攀登計(jì)劃項(xiàng)目共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31702333), China Agriculture Research System (CARS-47-G03), and Taishan Scholar Climbing Program of Shandong Province]. 吳垚磊，E-mail: 1305495981@qq.com

(編輯 馮小花)