延飛飛 李宏武

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科（沈陽110032）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大癌癥致死的主要原因之一［1］。奧沙利鉑是治療CRC 最常用的藥物之一［2］。通過誘導(dǎo)鏈內(nèi)加合物的形成，奧沙利鉑可以抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，促進(jìn)增殖細(xì)胞的死亡［3］。然而，新生和獲得性奧沙利鉑耐藥顯著降低了該藥物治療CRC 的療效［4］。因此，深入研究CRC 耐藥的分子機(jī)制，提高臨床治療效果具有重要意義。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是小的、非編碼的單鏈RNA 分子［5］。據(jù)報(bào)道，miRNAs 的失調(diào)有助于多種癌癥的發(fā)生，包括CRC［6］。CRC 患者血漿外泌體中miR-23b的表達(dá)水平較正常健康人明顯降低，其低表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯顯著相關(guān)［7］。此外，許多miRNA 已經(jīng)被確定通過調(diào)控靶基因參與CRC 的化療耐藥［8］。先前的研究表明CRC患者血清miR-140-5p較對(duì)照組明顯下調(diào)，并與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)［9］。KOUSTAS 等［10］研究表明miR-140-5p 的下調(diào)與CRC 的晚期和較低的總生存率顯著相關(guān)。miR-140-5p通過抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲而起到抑癌作用。因此，miR-140-5p可能在CRC中起到抑癌作用，以作為一種新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，miR-140-5p在CRC耐藥中的研究鮮有報(bào)道。

細(xì)胞自噬通過降解細(xì)胞器來使其適應(yīng)缺氧或營養(yǎng)缺乏等腫瘤微環(huán)境，研究表明自噬在CRC 的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用［11］。因此，探討CRC中自噬調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于新型治療是必不可少。當(dāng)前研究表明自噬在參與CRC 細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用［12］。已有研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)miRNA在CRC自噬的調(diào)節(jié)中起著重要作用，這種調(diào)節(jié)可以影響腫瘤的進(jìn)展。miR-140-5p 在CRC 干細(xì)胞中的異位表達(dá)導(dǎo)致自噬破壞，抑制腫瘤干細(xì)胞生長和球形形成［13］。但是目前關(guān)于miR-140-5p 調(diào)控自噬在CRC 細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的相關(guān)作用尚未明確。

本文旨在研究miR-140-5p 對(duì)CRC 細(xì)胞奧沙利鉑的敏感性，并探索miR-140-5p 是否通過調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)CRC 細(xì)胞奧沙利鉑敏感性的影響，為臨床診治提供一定的策略。

1 材料與方法

1.1 組織來源和細(xì)胞培養(yǎng)收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院2018年12月至2019年12月之間手術(shù)切除的30 例CRC 組織標(biāo)本。本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者簽署知情同意書后進(jìn)行。3種人CRC細(xì)胞系（HT-29，RKO，HCT-116）和1種人回盲腸腺癌細(xì)胞系（HCT-8）及正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞FHC 均購置于中國生命科學(xué)院上海細(xì)胞研究所（中國，上海）。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640 添加10%胎牛血清（Hyclone 公司，美國），在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 RNA 提取及qPCR 檢測使用Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）用于裂解細(xì)胞并收集RNA，后加入1/5 體積氯仿離心，取上清加入等體積異丙醇過夜。使用Power SYBR Green（TaKaRa 公司，大連）做real-Time PCR 分析。miR-140-5p 上游引物：5′-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；β-Actin 上游引物：5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3′，下游引物：5′-CTG-CTTGCTGATCCACATCTG-3′。實(shí)時(shí)PCR 和數(shù)據(jù)收集基于ABI 7500 平臺(tái)。miR-140-5p 相對(duì)于β-Actin 的表達(dá)采用2-ΔΔCt法計(jì)算并標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-140-5p 過表達(dá)質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P基因公司，選用miR-NC 空白載體作為陰性對(duì)照。將CRC 細(xì)胞株HCT 116 按每孔5 × 105個(gè)種于6 孔板中，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，用miR-140-5p mimics 以及相應(yīng)的陰性對(duì)照miR-NC 通過Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，上海）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h 后收獲細(xì)胞用于RT-qPCR 檢測，72 h 后用于western blot 檢測。

1.4 CCK-8 法測定細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔板中（5 × 103個(gè)/孔），各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入10%CCK-8培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。最后，用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長下各樣本的OD值。

1.5 Western blot 法檢測蛋白表達(dá)收集不同處理因素下的細(xì)胞，用預(yù)冷卻的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）液將其沖洗兩次。然后快速加入細(xì)胞裂解緩沖液以使細(xì)胞裂解。收集蛋白質(zhì)后，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測蛋白質(zhì)濃度，定完蛋白濃度后各樣品加入5×上樣緩沖液煮沸5 min。配好膠后加入相同量的蛋白質(zhì)，之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。隨后，在50 V 恒定電壓的情況下轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，然后用5%干燥的脫脂乳密封PVDF 膜2 h，用特定抗體孵育一抗、二抗，進(jìn)而檢測特定蛋白（LC3、β-actin 抗體購置于Cell Signaling Technology 公司）的表達(dá)，β-Actin 作為對(duì)照。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測自噬小體將爬片放入6 孔板中，將穩(wěn)定表達(dá)的HCT 116 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁且生長到80%左右，分別轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics 以及miR-NC，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 之后每孔加入預(yù)冷的4%多聚甲醛1 mL 室溫固定20 min，漂洗三次后每孔加入0.5% TritonX-100 室溫下孵育10 min。漂洗三次后加入2%BSA 室溫下封閉30 min。之后加入LC3 一抗，孵育過夜后避光加入熒光二抗（綠色標(biāo)記），滴加DAPI 復(fù)染核（藍(lán)色標(biāo)記）。以miR-NC作為陰性對(duì)照，在熒光顯微鏡下檢測各組CRC細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)的分布與數(shù)量。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長的CRC 細(xì)胞，用0.25%胰蛋白消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中備用。以每孔100 個(gè)細(xì)胞密度接種6 孔板中，待24 h 細(xì)胞貼壁后分別給予不同的處理方式，置37 ℃、5% CO2的濕潤的環(huán)境下培養(yǎng)1 ～2 周，經(jīng)常觀察，當(dāng)在顯微鏡下出現(xiàn)團(tuán)狀克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS 小心浸洗2 次，每孔加入4%多聚甲醛固定15 min，之后用結(jié)晶紫染色10 min，然后用流水緩慢洗去染色液，干燥后進(jìn)行圖片采集。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析SPSS 軟件（SPSS 22.0）用于進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。Image J 進(jìn)行蛋白和熒光定量分析，GraphPad Prism7.0 和Photoshop 和用于圖像處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05 則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 過表達(dá)miR-140-5p促進(jìn)CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性為檢測過表達(dá)miR-140-5p對(duì)CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，用miR-NC和miR-140-5p mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞系HCT-116，構(gòu)建miR-140-5p過表達(dá)細(xì)胞。RT-qPCR 用于分析miR-140-5p 表達(dá)。miR-NC 的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為1，miR-140-5p mimics轉(zhuǎn)染組的miR-140-5p 相對(duì)高表達(dá)（P=0.000 2，圖2A）。之后利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測miR-NC 和miR-140-5p mimics 轉(zhuǎn)染組在不同濃度奧沙利鉑處理24 h 下的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，在5 μmol/mL［（78.767±3.365）vs.（60.800±4.300）］、10 μmol/mL［（63.900±4.011）vs.（37.600 ± 5.251）］、15 μmol/mL［（52.433±6.104）vs.（28.567±2.909）］、20 μmol/mL［（50.800±3.351）vs.（21.200±4.518）］濃度的奧沙利鉑處理24 h 下，過表達(dá)miR-140-5p 促進(jìn)CRC 細(xì)胞系HCT-116對(duì)奧沙利鉑的敏感性（P＜0.000 1,圖2B）。

圖2 不同濃度奧沙利鉑處理下，過表達(dá)miR-140-5p 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-140-5p on the cell viability of CRC cells treated with different concentrations of oxaliplatin

2 結(jié)果

2.1 miR-140-5p 在CRC 組織中及細(xì)胞系中的表達(dá)RT-qPCR 用于檢測30 例CRC 組織及相應(yīng)癌旁組織樣本中miR-140-5p 表達(dá)，癌旁組織表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為1，CRC 組織中的miR-140-5p 的平均表達(dá)水平低于癌旁組織（0.343±0.107），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0015，圖1A）。RT-qPCR 用于分析細(xì)胞中miR-140-5p 的表達(dá)，正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（FHC）的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為1，結(jié)果表明在HCT-8、HT-29、RKO、HCT-116 中miR-140-5p 的表達(dá)低于FHC 細(xì)胞，其中HCT-116 細(xì)胞系差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1B）。

圖1 miR-140-5p 在CRC 組織中及細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-140-5p in CRC tissues and cell lines

2.3 過表達(dá)miR-140-5p 抑制CRC 細(xì)胞的自噬由于自噬在CRC 的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的調(diào)控因素，檢測miR-140-5p 是否能調(diào)節(jié)CRC 細(xì)胞的自噬。Western blot 檢測LC3 蛋白的表達(dá)，與miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics 后LC3 II/I 表達(dá)水平相對(duì)降低（P=0.008，圖3A、B）。為進(jìn)一步證實(shí)miR-140-5p 對(duì)自噬水平的影響，免疫熒光進(jìn)行檢測與western blot 結(jié)果一致，miR-140-5p 過表達(dá)組LC3 熒光表達(dá)減弱（圖3C）。綜上，過表達(dá)miR-140-5p 抑制CRC 細(xì)胞自噬的表達(dá)水平。

圖3 過表達(dá)miR-140-5p 對(duì)CRC 細(xì)胞自噬的影響Fig.3 Effect of overexpression of miR-140-5p on autophagy of CRC cells

2.4 過表達(dá)miR-140-5p 合并雷帕霉素減弱CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性為驗(yàn)證miR-140-5p 是否通過自噬對(duì)奧沙利鉑的敏感性產(chǎn)生作用，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics 并使用自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin，Rapa）共同處理，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與過表達(dá)miR-140-5p相比，過表達(dá)miR-140-5p并處理Rapa 組的LC3 熒光表達(dá)增強(qiáng)（圖4A）。CCK-8 結(jié)果表明在不同濃度的奧沙利鉑處理下，miR-140-5p 加Rapa 組能夠逆轉(zhuǎn)miR-140-5p 組導(dǎo)致的增殖減少情況（P= 0.001 9, 圖4B）。此外，選取在奧沙利鉑10 μmol/L 進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，奧沙利鉑處理下細(xì)胞克隆水平降低（P＜0.000 1）；過表達(dá)miR-140-5p加Rapa組的細(xì)胞菌落相比過表達(dá)miR-140-5p 組更多（P= 0.003 9，圖4C）。以上結(jié)果表明，miR-140-5p 能調(diào)控自噬從而影響CRC 細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。

圖4 過表達(dá)miR-140-5p 并促進(jìn)自噬后，CRC 細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性Fig.4 Sensitivity of CRC cells to oxaliplatin after overexpression of miR-140-5p and promotion of autophagy

3 討論

在癌癥治療中，治療耐藥性是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。奧沙利鉑耐藥是目前CRC 化療的主要障礙之一。盡管腫瘤治療取得了很大進(jìn)展，但由于化療耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，大多數(shù)臨床有效的化療誘導(dǎo)劑都是無效的［1］。

近年來，miRNA 的異常表達(dá)與CRC 化療耐藥的發(fā)生有關(guān)［12］。miR-302a 在西妥昔單抗耐藥的CRC 細(xì)胞中的表達(dá)降低，過表達(dá)miR-302a 在功能上抑制了CRC 細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，且miR-302a 的高表達(dá)恢復(fù)了CRC 細(xì)胞對(duì)野生型KRAS 和BRAF 基因的化療反應(yīng)性［13］。miR-140-5p 是被認(rèn)為在CRC 的發(fā)展中起到抑癌的作用，其可通過直接靶向SOX4 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲［14］。此外，miR-140-5p 可抑制CRC 的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［15］。但miR-140-5p 調(diào)控CRC 耐藥的分子機(jī)制尚未有研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明，在CRC細(xì)胞中miR-140-5p 呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，而過表達(dá)miR-140-5p 后促進(jìn)了CRC 細(xì)胞奧沙利鉑的敏感性，本研究結(jié)果與前所述一致，這說明miR-140-5p 在CRC 中主要發(fā)揮抑癌的作用。然而miR-140-5p對(duì)CRC化療藥物敏感性的研究目前國內(nèi)外尚無報(bào)道，本研究表明miR-140-5p 可以促進(jìn)CRC 細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。

越來越多的文獻(xiàn)表明，自噬可能有助于癌癥發(fā)展。自噬激活可促進(jìn)癌細(xì)胞存活（保護(hù)性自噬）或?qū)е掳┘?xì)胞死亡（細(xì)胞毒性/非保護(hù)性自噬）［16-17］。有研究表明阿帕替尼治療CRC 細(xì)胞時(shí)可以誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，而阿帕替尼與自噬抑制劑氯喹聯(lián)合應(yīng)用在體外和體內(nèi)均具有最顯著的抗腫瘤作用［18］。miR-489在大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞和多個(gè)耐藥的乳腺癌細(xì)胞中均處于下調(diào)狀態(tài)，其可以通過抑制自噬來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性［19］。而miR-140-5p 在CRC 中的調(diào)控自噬的分子機(jī)制尚不清楚。本研究表明過表達(dá)miR-140-5p 可以抑制CRC 細(xì)胞的自噬并提高對(duì)奧沙利鉑的敏感性，而過表達(dá)miR-140-5p 并使用自噬激活劑雷帕霉素時(shí)卻降低了對(duì)奧沙利鉑的敏感性，那么miR-140-5p參與調(diào)控CRC細(xì)胞自噬的哪個(gè)階段，還有待進(jìn)一步的探究。

綜上所述，miR-140-5p 在CRC 細(xì)胞中低表達(dá)，其過表達(dá)通過抑制自噬促進(jìn)了CRC 細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，不僅為CRC的臨床診治提供了有力的理論基礎(chǔ)，還為CRC的靶向治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)。