魏建國 段東明 井一涵 婁愛菊 曾裕威 劉子愷 王簕

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院1骨科，2再生醫(yī)學(xué)與3D 打印轉(zhuǎn)化中心（廣州510150）；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬荔灣醫(yī)院風(fēng)濕科（廣州510150）

組織修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，基本包括炎癥反應(yīng)期，肉芽生成期，以及組織塑形期。細(xì)胞作為器官組織的基本構(gòu)成單位，需要細(xì)胞大量增殖、分化來形成組織［1］。而組織修復(fù)需要生長因子在時間空間上相互調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、成血管以及組織生長的基因表達(dá)［2］。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）是血小板α 顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)，當(dāng)PDGF 和靶細(xì)胞的受體結(jié)合后，細(xì)胞合成新的DNA，從而促進細(xì)胞有絲分裂而增殖［3］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，在血管系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展過程中起著明顯的調(diào)節(jié)作用［4-5］。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，PDGF 和VEGF 將被越來越多的應(yīng)用于再生修復(fù)治療，如治療老年性骨量丟失、糖尿病創(chuàng)面等［6-8］。近來，生物材料在醫(yī)學(xué)再生領(lǐng)域研究以及應(yīng)用較為火熱，如水凝膠、3D 打印支架等［9-11］。這些材料基本由明膠（gelatin）或者PCL 等為基材，通過化學(xué)或物理方式對其進行改造成為生物修復(fù)材料，并負(fù)載藥物如生長因子，給組織提供修復(fù)微環(huán)境以促成骨或促成血管［12-13］。

雖然生長因子對組織修復(fù)的作用很重要，但目前學(xué)術(shù)界對于如何把控生長因子的劑量使用研究鮮有報道［14-16］，推測存在一個生長因子濃度，對組織修復(fù)有最佳的效應(yīng)。本研究將使用不同濃度的PDGF-BB 和VEGF-A，在二維和三維培養(yǎng)條件下，探討其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖效率的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料PDGF-BB（近岸蛋白）、VEGF-A（MCE）、明膠（typeA，sigma）、透明質(zhì)酸（40 kDa，華熙福瑞達(dá)）、lenti-eGFP（CyagenBiosciences）、HUVEC（CyagenBiosciences），tryple（Gibco）、CCK-8（碧云天）、Carbohydrazide（HDZ，Aladdin）、1-Hydroxybenzotriazolemonohydrate（HOBt，Aladdin）、1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimidehydrochloride（EDC，Aladdin）、（S）-3-Amino-1，2-propanedlol（Aladdin）、NaIO4（Macklin），EG（Ethylene Glycol，Macklin），ECM（EndothelialCellMedium，ScienCell），F(xiàn)BS（Gibco），雙抗（Solarbio），熒光顯微鏡（OlympusIX83），酶標(biāo)儀（TECANM200pro）。

1.2 實驗分組在完全培養(yǎng)基中加入不同濃度的PDGF-BB 或者VEGF-A，按因子濃度將實驗分成以下組：0 μg/mL 組（Control組）、0.02 μg/mL GFs組、0.2 μg/mL GFs 組、2 μg/mL GFs 組、5 μg/mL GFs組，每組至少設(shè)置3 個復(fù)孔。

1.3 水凝膠材料的制備作為三維培養(yǎng)的生物材料，用經(jīng)碳酰肼改性的gelatin 和醛基修飾的HA，碳酰肼基團和醛基之間交聯(lián)形成穩(wěn)定的希夫堿［17］，凝膠整體較為穩(wěn)定。對于Gel-CDH 的合成，準(zhǔn)備300 mL 的1%明膠水溶液，劇烈攪拌下加入6.49 g HDZ，1.1 g HOBt，調(diào)節(jié)溶液pH 4.7，反應(yīng)1 h 后加入0.46 g EDC，反應(yīng)過夜。第二天經(jīng)0.3 mol/L NaCl，純水透析4 d，最后凍干得Gel-CDH。對于HA-mCHO的合成，其分兩步反應(yīng)；首先，準(zhǔn)備500 mL 的2%HA 水溶液，劇烈攪拌下加入4.55 g Amino，3.83 g HOBt，調(diào)節(jié)pH 6.0，反應(yīng)2 h后加入1.45 g EDC，反應(yīng)過夜。第二天經(jīng)0.3 mol/L NaCl，純水透析4 d，最后凍干得HA-mCHO-diol。準(zhǔn)備482 mL 的1%HAmCHO-diol 水溶液，劇烈攪拌下，加入2.58 g NaIO4水溶液，避光反應(yīng)5 min，隨后加入14.95 g EG，反應(yīng)2 h。0.3 mol/L NaCl，純水透析4 d，最后凍干得HA-mCHO。

1.4 HUVEC 的培養(yǎng)與lenti-eGFP 的轉(zhuǎn)染及觀察鑒定原代HUVEC 購買于Cyagen Biosciences，使用ECM 完全培養(yǎng)基接種于T75 培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在細(xì)胞狀態(tài)良好的早期代數(shù)中消化并收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞至5 × 105/mL，再接種于24 孔板內(nèi)，每孔1 mL 細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日，將慢病毒、Polybrene 取出，于冰浴融解并保持低溫狀態(tài)；取20 μL/孔對應(yīng)的lenti-eGFP 總量加入到對應(yīng)培養(yǎng)基中，輕柔混勻；再加入5 μg/mL 對應(yīng)的Polybrene 輕柔搖勻，吸去原有培養(yǎng)基，PBS 沖洗1 次；加入含lenti-eGFP 培養(yǎng)基；輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。24 h 后，吸去原有l(wèi)enti-eGFP 培養(yǎng)基，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，得到lenti-GFP HUVEC。24 h 及72 h 觀察熒光轉(zhuǎn)染效果。

1.5 二維條件下給予不同濃度生長因子的GFPHUVEC培養(yǎng)效果觀察實驗對象取自上述實驗經(jīng)GFP 轉(zhuǎn)染的HUVEC。GFP-HUVEC 按照1 × 105/mL接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)1 d以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。隨后，在狀態(tài)良好情況下，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS 洗滌1 次，加入新鮮的含不同濃度PDGF-BB或者VEGF-A的1 mL 完全培養(yǎng)基，每天更換1 次新鮮培養(yǎng)基。按照預(yù)定分組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。在第1、4、7 天時，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，并使用image-Jv1.58 軟件對熒光數(shù)量進行半定量分析。

1.6 二維條件下CCK-8HUVEC 增殖檢測實驗對象取自上述實驗第4 代HUVEC，使用tryple 收集足夠數(shù)量并且狀態(tài)良好的HUVEC，以5 × 103/mL數(shù)量接種至24 孔板內(nèi)，培養(yǎng)1 d 以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。而后在細(xì)胞狀態(tài)良好情況下，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS 洗滌1 次，加入新鮮的含不同濃度PDGF-BB 或者VEGF-A 的100 μL 完全培養(yǎng)基，每天按此換液1 次。按照預(yù)定分組，每組設(shè)置5 個復(fù)孔。在第1、4、7 天時，按照CCK-8 說明書檢測OD值。

1.7 三維條件下給予不同濃度生長因子的GFPHUVEC 培養(yǎng)效果觀察實驗對象取自上述實驗經(jīng)GFP 轉(zhuǎn)染的HUVEC。首先取Gel-CDH 制備4%的PBS 溶液于無菌EP 管中，置于37 ℃中備用。再取HA-mCHO 制備5.34%的PBS 溶液于無菌EP 管中，用0.22 μm 濾膜過濾殘渣后備用。收集足夠數(shù)量并且狀態(tài)良好的GFP-HUVEC，用PBS 重懸至2 × 106/mL，然后以此細(xì)胞懸液稀釋等量的HAmCHO 溶液至2.67%。最后，25 μL Gel-CDH 和含細(xì)胞的25 μL HA-mCHO 劇烈混合，并靜置30 min以充分反應(yīng)。凝膠放入24 孔板，每孔含1 mL 不同濃度PDGF-BB 或者VEGF-A 的完全培養(yǎng)基。每孔設(shè)置3 個復(fù)孔。在第1、4、7 天時，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，并使用imageJv1.58 軟件對熒光數(shù)量進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用（）表示，由統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析，graphpadprismv 8.0 進行數(shù)據(jù)繪圖展示。實驗各組樣本結(jié)果均數(shù)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC 培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染效果HUVEC 按照供應(yīng)商的實驗方法并結(jié)合本實驗研究計劃進行培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染lenti-eGFP，細(xì)胞狀態(tài)良好，可以用于后續(xù)的實驗（圖1）。

圖1 HUVEC 培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染后1 d 和3 d 的效果Fig.1 Effects of HUVEC culture and lentivirus transfection on day 1 and day 3

2.2 二維條件下給予不同濃度生長因子的GFPHUVEC 培養(yǎng)效果為了觀察鏡下HUVEC 的生長情況，按照預(yù)定實驗計劃，除了使用完全培養(yǎng)基外，對實驗對象額外單獨添加兩種不同濃度的PDGFBB 和VEGF-A，以不加生長因子作為實驗對照組。在PDGF-BB 實驗組內(nèi)（圖2a-b），在第1、4、7 天，2 μg/mL 組始終保持較高的熒光數(shù)量（P＜0.01）；同樣，在VEGF-A 組實驗組內(nèi)（圖2c-d），0.2 μg/mL組表現(xiàn)出相同趨勢（P＜0.05）。此外還觀察到，5 μg/mL 組呈現(xiàn)低熒光數(shù)量?？梢?，2 μg/mL 的PDGFBB或者0.02 μg/mL 的VEGF-A 對HUVEC起明顯促進效果（P＜0.05）。

圖2 不同濃度PDGF-BB 或VEGF-A 下HUVEC 在孔板中的生長情況Fig.2 Proliferation of HUVEC in plate with different concentrations of PDGF-BB or VEGF-A

2.3 二維條件下CCK-8 檢測HUVEC 增殖結(jié)果為了檢測在二維條件下HUVEC 的增殖情況，在給予了不同濃度PDGF-BB 或者VEGF-A 后進行了CCK-8 檢測，見圖3。在第1 天時，PDGF-BB 實驗組內(nèi)，與對照組相比，2 μg/mL 與5 μg/mL 細(xì)胞增殖情況有所下降（P＜0.05），而其余組卻無明顯差別（P＞0.05）；但在第4、7 天時，2 μg/mL 組保持較高增殖活性（P＜0.05）。在VEGF-A 組內(nèi)，第1、4、7天時，0.02 μg/mL 組始終保持較高的增殖活性（P＜0.05）。但觀察到兩個因子5 μg/mL 組表現(xiàn)較低甚至是抑制效應(yīng)。說明這與上述的結(jié)果相一致，并且過高的因子濃度可能會出現(xiàn)抑制效應(yīng)。

圖3 CCK-8 檢測不同濃度生長因子對HUVEC 增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of growth factors detected by CCK-8 on HUVEC proliferation

2.4 三維條件下給予不同濃度生長因子的GFPHUVEC 培養(yǎng)結(jié)果按照預(yù)定實驗計劃，將轉(zhuǎn)染了慢病毒的HUVEC 包裹進水凝膠里面，以模擬三維生長環(huán)境，并在培養(yǎng)基中添加不同濃度生長因子，觀察其生長情況。在第1、4、7 天，PDGF-BB 組內(nèi)2 μg/mL 始終表現(xiàn)出較多熒光數(shù)量（P＜0.01）。VEGF-A 組內(nèi)0.02 μg/mL 與前者表現(xiàn)出相同趨勢（P＜0.01）。說明在三維條件下，仍以2 μg/mL 的PDGF-BB 或0.02 μg/mL 的VEGF-A 對HUVEC 有更好的促進效應(yīng)，過高的因子濃度可能會出現(xiàn)抑制，這與上面的實驗結(jié)果較為相符。

3 討論

生長因子是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞組織正常生長代謝所必需的有機物，其可控制組織缺損修復(fù)、創(chuàng)面愈合等過程中的許多關(guān)鍵細(xì)胞活動，如新血管生成、細(xì)胞遷移與增殖等［18-19］。由于生長因子良好的修復(fù)作用，所以為各種原因?qū)е碌膭?chuàng)傷治療帶來了新的希望。水凝膠是生物相容性較高的再生修復(fù)材料，負(fù)載生長因子之后，它可以隨時間而逐漸降解并釋放更多的生長因子，因而進一步促修復(fù)，形成良性循環(huán)，最終材料降解消失，組織愈合［20-21］。LIENEMANN 等［22］和賈樂寧等［23］用含生長因子的水凝膠研究修復(fù)效應(yīng)，得出其能明顯促進骨缺損修復(fù)和新血管生成的結(jié)論。

雖然生長因子已被廣泛使用，但許多研究對其劑量的效應(yīng)探討并無詳細(xì)贅述，如果在治療修復(fù)方面每次都使用大劑量，那可能將會對患者產(chǎn)生過高的消費，副作用及其他未知問題［24］。在此，筆者探討了較低濃度下的PDGF-BB 和VEGF-A 對于再生修復(fù)的效果。以GFP-HUVEC 為實驗對象，將其接種在孔板上或者在水凝膠里面，再添加不同濃度的PDGF-BB 和VEGF-A 進行培養(yǎng)，用lenti-GFP的熒光和CCK-8 來檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 μg/mL 的PDGF-BB 或0.02 μg/mL 的VEGF-A 始終對細(xì)胞表現(xiàn)出促進作用。

雖然已基本證實有一個濃度的生長因子對細(xì)胞表現(xiàn)出最佳促效應(yīng)，但是在凝膠實驗中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在其中生長速率總體比在孔板中較慢。水凝膠是含大量水、少量gelatine 和HA 組成的生物材料，形成有一定密閉性的微環(huán)境，而HUVEC 生長會涉及延伸、黏附以及成網(wǎng)等。猜測這可能水凝膠對培養(yǎng)基中的物質(zhì)通透、對細(xì)胞的生長限制等有關(guān)。如能對凝膠的理化性質(zhì)如物質(zhì)通透性等進行測試，可能將更了解該凝膠對細(xì)胞的生物兼容性。

綜上所述，得出結(jié)論，2 μg/mL PDGF-BB 和0.02 μg/mL VEGF-A 對HUVEC 產(chǎn)生的增殖效果最好，過高濃度的生長因子對于其可能有抑制作用。但本研究只在細(xì)胞層面驗證了該結(jié)論，由于體內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜性，尚不清楚在動物模型上是否得到相同的結(jié)論。后續(xù)會在本文基礎(chǔ)上增加動物模型實驗，使結(jié)論更具可靠性。

圖4 不同濃度PDGF-BB 或VEGF-A 下HUVEC 在凝膠中的生長情況Fig.4 Proliferation of HUVEC in hydrogels with different concentrations of PDGF-BB or VEGF-A