張松松 劉曼莉 王金龍 潘渝 施賢清

貴州省人民醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2重癥監(jiān)護(hù)室（貴陽550002）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）屬持續(xù)氣流受限和不完全可逆的肺部疾病，發(fā)生率逐年升高，細(xì)菌感染是導(dǎo)致此病的主要因素［1-2］。微小RNA（miR）屬于一類內(nèi)源性非編碼RNA，隨著臨床上對其的不斷研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)miR 參與COPD 的進(jìn)展，如miR-146a、miR-155、miR-145 等，已經(jīng)證實多數(shù)miR 參與COPD 發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)的調(diào)控［3］?；谏鲜霰尘霸诒疚难芯恐惺状畏治鰉iR-132 是否經(jīng)PGC-1α/SIRT3信號通路對肺炎鏈球菌誘慢性阻塞性肺疾病加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）大鼠的干預(yù)作用，明確其作用，為臨床上此病的研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料研究動物：選取60 只SPF 級SD 雄性大鼠，8～12 周齡，購自冠科生物技術(shù)（中山）有限公司，動物許可證號：SYXK（粵）2020-0240，體質(zhì)量160～210 g，均預(yù)喂養(yǎng)7 d，光照12 h。獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模選取15只大鼠作為A組，其余構(gòu)建肺炎鏈球菌所誘導(dǎo)的AECOPD 模型［4］，置于煙熏箱，放置香煙，3 個月后自氣道注入0.2 mL 肺炎鏈球菌混懸液。成功標(biāo)準(zhǔn)：初期可見有呼吸短促、精神不振、食欲減退、納呆等表現(xiàn)，繼而出現(xiàn)氣喘、毛色暗淡、反應(yīng)遲鈍。最終45 只均建模成功。將所制備的模型隨機(jī)分為B 組（單純模型）、C 組（模型+沉默）、D 組（模型+過表達(dá)）各15 只。

1.2.2 miR-132轉(zhuǎn)染將miR-132模擬物（過表達(dá)）、miR-132 抑制物（沉默）利用Lippofectamine 2000 試劑盒稀釋為5 mmol/L，分別注射于D組、C組大鼠肺部，A、B組注射生理鹽水，注射1 d后觀察大鼠變化。

1.2.3 miR-132 轉(zhuǎn)染效率驗證取各組中5 只鑒定miR-132 轉(zhuǎn)染效率，麻醉后處死，取肺組織，采用RT-PCR 法檢測miR-132 轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 指標(biāo)檢測（1）全自動動物肺功能測試儀測定肺功能，包括0.3 s 用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV0.3/FVC）、吸氣峰流量（PIF）、呼氣峰流量（PEF）。（2）貝克曼血液分析儀測定白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)。（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。（4）Western blot法檢測肺組織PGC-1α/SIRT3 信號通路蛋白表達(dá)量，將所制備的肺組織做10 000 ×g離心處理10 min，BCA 蛋白定量，DAB 顯色，分析PGC-1α、SIRT3 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間采用方差分析，兩組間采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-132 表達(dá)對比與A 組相比，B、C 組miR-132 降低，D 組miR-132 升高（P＜0.05）。見表1。

表1 miR-132 表達(dá)對比Tab.1 miR-132 expression contrast ±s

表1 miR-132 表達(dá)對比Tab.1 miR-132 expression contrast ±s

注：與A 組相比，aP＜0.05；與B 組相比，bP＜0.05；與C 組相比，cP＜0.05

組別例數(shù)miR-132 A 組B 組C 組D 組5 5 5 5 1.00±0.01 0.63±0.15a 0.19±0.07ab 1.69±0.32abc

2.2 肺功能對比B、C、D組FEV0.3/FVC、PIF、PEF低于A 組（P＜0.05）；C 組FEV0.3/FVC、PIF、PEF 低于B 組，D 組FEV0.3/FVC、PIF、PEF 高于B、C 組（P＜0.05）。見表2。

表2 肺功能對比Tab.2 Pulmonary function comparison ±s

表2 肺功能對比Tab.2 Pulmonary function comparison ±s

注：與A 組相比，aP＜0.05；與B 組相比，bP＜0.05；與C 組相比，cP＜0.05

組別A 組B 組C 組D 組例數(shù)10 10 10 10 FEV0.3/FVC（%）84.96±6.79 61.02±3.65a 52.34±2.13ab 77.82±5.16abc PIF 4.98±1.04 2.34±0.24a 1.86±0.12ab 3.89±0.86abc PEF 3.56±0.96 1.86±0.38a 1.04±0.21ab 2.57±0.34abc

2.3 白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)、氣道炎癥反應(yīng)對比B、C、D 組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)、IL-1β、IL-6、TNF-α 高于A 組（P＜0.05）；C 組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)、IL-1β、IL-6、TNF-α 高于B 組，D 組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)、IL-1β、IL-6、TNF-α 低于B、C 組（P＜0.05）。見表3。

表3 白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)、氣道炎癥反應(yīng)對比Tab.3 Comparison of total leukocyte counts，neutrophils，airway inflammatory responses ±s

表3 白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比計數(shù)、氣道炎癥反應(yīng)對比Tab.3 Comparison of total leukocyte counts，neutrophils，airway inflammatory responses ±s

注：與A 組相比，aP＜0.05；與B 組相比，bP＜0.05；與C 組相比，cP＜0.05

組別A 組B 組C 組D 組例數(shù)10 10 10 10白細(xì)胞總數(shù)（×109）1.82±0.49 10.25±2.19a 14.52±2.63ab 5.13±1.01abc中性粒細(xì)胞百分比（%）23.36±2.46 67.52±6.49a 76.68±7.26ab 35.15±3.19abc IL-1β 2.00±0.38 6.24±1.02a 8.49±2.24ab 3.59±0.54abc IL-6 2.32±0.55 5.42±0.32a 6.98±1.05ab 3.02±0.21abc TNF-α 1.52±0.24 7.68±1.04a 9.52±2.69ab 2.89±0.52abc

2.4 PGC-1α/SIRT3 蛋白表達(dá)對比B、C、D 組PGC-1α、SIRT3 表達(dá)低于A 組（P＜0.05）；C 組PGC-1α、SIRT3 表達(dá)低于B 組，D 組PGC-1α、SIRT3 表達(dá)高于B、C 組（P＜0.05）。見表4。

表4 PGC-1α/SIRT3 蛋白表達(dá)對比Tab.4 PGC-1α/SIRT3 protein expression contrast x±s

3 討論

COPD 的發(fā)生多因接觸有害氣體、細(xì)菌感染所致，急性期更為嚴(yán)重，患者病死率較高，目前對于此病的治療手段雖較多，但整體療效不理想，多數(shù)患者預(yù)后仍不佳［5-6］。因此尋找新的治療COPD 的靶點對改善患者預(yù)后、促進(jìn)患者疾病恢復(fù)具有重要的意義。

miR 屬于一類非編碼的內(nèi)源性微小RNA，其可經(jīng)介導(dǎo)mRNA 降解、抑制轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控多種基因表達(dá)的作用，多種miR 參與機(jī)體局部炎癥反應(yīng)［7-8］。miR-132 屬于miR 家族成員之一，其具有進(jìn)化保守性，參與機(jī)體多種生理病理過程［9-11］。臨床多項研究顯示［12-13］，miR-132 參與COPD 肺損傷的修復(fù)?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，在本文研究中為了進(jìn)一步驗證miR-132 是否可作為COPD 治療的新靶點，結(jié)果顯示，經(jīng)miR-132 過表達(dá)處理的大鼠氣道炎癥反應(yīng)被抑制，肺功能改善，而miR-132沉默處理的大鼠上述表現(xiàn)更為嚴(yán)重。此結(jié)果提示，miR-132 可能參與COPD 的進(jìn)展。

COPD 發(fā)生后肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象，而肺泡上皮細(xì)胞的凋亡可進(jìn)一步破壞肺泡-上皮屏障，最終形成肺水腫［14-15］。PGC-1α/SIRT3通路與細(xì)胞凋亡相關(guān)，PGC-1α 屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子成員之一，具調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體代謝、局部炎癥反應(yīng)作用［16-18］。SIRT3 屬PGC-1α 的下游靶基因，其在線粒體基質(zhì)中所表達(dá)，PGC-1α 被激活后可經(jīng)誘導(dǎo)SIRT3 表達(dá)增加SIRT3 活性，最終參與細(xì)胞凋亡、線粒體氧化代謝等過程［19-22］。謝圓媛等［23］研究認(rèn)為PGC-1α/SIRT3 通路與COPD 相關(guān)，經(jīng)激活此信號通路可抑制氣道炎癥發(fā)揮作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)miR-132 過表達(dá)處理的大鼠肺組織PGC-1α/SIRT3信號通路蛋白表達(dá)明顯升高，因此本文進(jìn)一步推測miR-132 可能經(jīng)激活PGC-1α/SIRT3信號通路可抑制氣道炎癥，修復(fù)損傷的肺功能。

綜上所述，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-132 模擬物可抑制肺炎鏈球菌誘AECOPD 氣道炎癥，修復(fù)肺損傷，機(jī)制可能與激活PGC-1α/SIRT3 信號通路PGC-1α 上調(diào)SIRT3 相關(guān)。