陳云霞，司 捷，高 倩，楊衛(wèi)國，楊繼軍

?KEYWORDS:diabetic retinopathy; microangiopathy; micro RNA; miR-27; vascular endothelial growth factor

0引言

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是以糖代謝紊亂為特點(diǎn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)系其常見、嚴(yán)重全身微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致患者視功能受損的重要原因[1]。調(diào)查顯示，T2DM患者DR患病率超過30%，且有明顯逐漸上升趨勢(shì)[2]。當(dāng)前尚未完全明確DR發(fā)病機(jī)制，早期多認(rèn)為與高糖應(yīng)激損傷、糖基化終末產(chǎn)物及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損等機(jī)制有關(guān)[3-4]。T2DM長期血糖控制不佳，可引起視網(wǎng)膜局部血管血流動(dòng)力學(xué)改變，造成視網(wǎng)膜缺血、缺氧，導(dǎo)致多種炎癥細(xì)胞因子及促血管內(nèi)皮生長因子釋放，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成[5]。近年來越來越多證據(jù)顯示，微小RNA(miRNA，miR)參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程，與血管病變密切相關(guān)，影響血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[6-7]。miR-27首次在宮頸癌細(xì)胞株內(nèi)發(fā)現(xiàn)，已證實(shí)在心血管病變中有關(guān)鍵作用，直接參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過程，同時(shí)對(duì)機(jī)體脂代謝產(chǎn)生影響[8]。近期有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，T2DM高糖環(huán)境可誘導(dǎo)miR-27表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、組織纖維化等血管病變過程[9]。但對(duì)miR-27在DR發(fā)病過程中的作用尚未明確。本研究現(xiàn)對(duì)收治的DR患者80例血漿miR-27、血清VEGF進(jìn)行檢測(cè)，并與單純T2DM、正常健康人對(duì)照，以明確miR-27在DR發(fā)病及進(jìn)展中的作用，以期為DR防治提供依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性研究。收集我院2019-01/2020-01收治的DR患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：DR診斷與分期滿足中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)會(huì)眼底病學(xué)組通過的DR臨床診療指南(2014年)標(biāo)準(zhǔn)[10]，分期Ⅰ～Ⅵ期，經(jīng)眼底熒光素血管造影證實(shí)；原發(fā)性T2DM，病程2a及以上；眼壓正常；屈光介質(zhì)基本正常；未接受抗DR治療；臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心腦血管病變、肝腎功能衰竭、全身惡性腫瘤；近期有手術(shù)及創(chuàng)傷史；合并白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視神經(jīng)疾病等其他眼部疾患；糖尿病其他并發(fā)癥；因各類原因無法配合眼科檢查者；急慢性感染；長期糖皮質(zhì)激素應(yīng)用史或抗精神疾病類藥物應(yīng)用史者；合并庫欣綜合征、甲狀腺功能亢進(jìn)等其他影響糖代謝疾病者；自身免疫系統(tǒng)疾?。辉衅诨虿溉槠谂?；臨床資料不全。選擇同期收治未合并DR的單純T2DM患者40例作為T2DM組，均滿足中國T2DM防治指南中T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。同期來醫(yī)院體檢的正常健康人40例作為對(duì)照組，無T2DM病史，空腹血糖<6.1mmol/L，餐后2h血糖<7.8mmol/L，經(jīng)體格檢查體健，無心肝腎肺疾病、無風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病。本研究通過我院醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，所有受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集均由專人通過調(diào)取醫(yī)院信息系統(tǒng)內(nèi)所保存患者病例資料采集受試者性別、年齡、既往史、病程、血糖等資料。錄入Excel系統(tǒng)后，由2～3人復(fù)核，確定無遺漏、滿足入組標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)入研究，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2 miR-27檢測(cè)所有受試對(duì)象就診當(dāng)日均留取空腹肘靜脈血標(biāo)本5mL，參照Trizol總RNA抽提試劑盒(美國Thermo Fisher公司)提取RNA，參照GIAGEN試劑盒純化，RNA純度及濃度滿意后，電泳檢測(cè)RNA完整性。反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)(real time fluorescent quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR)法測(cè)定血漿miR-27表達(dá)，miR-27逆轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄，總RNA反轉(zhuǎn)錄呈擴(kuò)增模板cDNA，反轉(zhuǎn)錄特異性引物序列：miR-27上游引物序列：5’-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；內(nèi)參U6 上游引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(引物設(shè)計(jì)及合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成)，采用日本TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：5μL 2×Master Mix+PCR特異性上下游引物各0.5μL+雙蒸水補(bǔ)足至8μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火20s，60℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)，于61℃采集熒光信號(hào)，美國Bio-Rad公司FX-96型PCR儀檢測(cè)miR-27相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參，參照2-△△ct公式[12]計(jì)算miR-27相對(duì)表達(dá)量，每樣本均設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)測(cè)定3次取均值。

1.2.3 VEGF檢測(cè)受試當(dāng)日均采集外周空腹靜脈血3mL，5000r/min離心5min，分離血清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清VEGF水平，試劑盒購自美國R&D公司，嚴(yán)格按試劑使用說明操作。

2結(jié)果

2.1三組研究對(duì)象臨床資料比較DR組包括非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)54例，包括Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各12例、24例、18例；增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)26例，包括Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期各10例、11例、5例。三組性別構(gòu)成、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，糖尿病病程、空腹血糖、糖化血紅蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 三組研究對(duì)象臨床資料比較

表2 三組研究對(duì)象血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量及血清VEGF水平比較

表3 不同DR分期患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量、血清VEGF水平及血糖指標(biāo)比較

表4 DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量影響因素分析

2.2三組研究對(duì)象血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量及血清VEGF水平比較三組研究對(duì)象血漿miR-27、血清VEGF比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，DR組、T2DM組血漿miR-27、血清VEGF高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=23.749、9.235；20.661、4.682，P<0.05)，DR組又高于T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=13.085、15.254，P<0.05)，見表2。

2.3不同DR分期患者血miR-27相對(duì)表達(dá)量、VEGF水平及血糖指標(biāo)比較PDR患者血漿miR-27、血清VEGF、空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均高于NPDR患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4 DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量影響因素分析納入單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變量進(jìn)入多因素Logistic回歸分析(α入=0.05，α剔除=0.10)，結(jié)果顯示：病程、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清VEGF、DR分期均為DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量的影響因素(P<0.05)，見表4。

表5 DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量與血清VEGF、空腹血糖、糖化血紅蛋白的相關(guān)性分析

2.5 DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量與血清VEGF、空腹血糖、糖化血紅蛋白的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示：DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量與血清VEGF、空腹血糖、糖化血紅蛋白均呈正相關(guān)(P<0.05)，見表5，圖1。

3討論

DR為糖尿病最為嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一[13]。已明確DR是導(dǎo)致視功能受損及失明的重要原因[14]。但目前尚未完全闡明其發(fā)病機(jī)制，明確DR病因及病情進(jìn)展影響因素對(duì)DR防治有積極意義。近年來越來越多報(bào)道指出，DR為多基因參與階段性疾病，涉及多元醇通路激活、蛋白激酶C激活，與蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)、免疫炎癥反應(yīng)、VEGF基因及miRNA基因調(diào)控等密切相關(guān)[15-16]。其中miRNA在DR發(fā)病中的作用已成為臨床研究者關(guān)注的特點(diǎn)。已明確miRNA參與T2DM、心血管病變、炎癥反應(yīng)及惡性腫瘤形成等過程[17-18]。miRNA屬高度保守單鏈小分子RNA，調(diào)控超過50%的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及翻譯[19]。miR-27為首次在宮頸癌細(xì)胞株分離獲得的小分子RNA類型，位于17號(hào)染色體，已證實(shí)存在癌基因作用，參與乳腺癌、胰腺癌等多種實(shí)體瘤發(fā)病、增殖及遷移過程[20-21]。最新研究顯示，miR-27存在促血管生成作用，可通過抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)VEGF受體2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致血管新生[22]。而敲除miR-27表達(dá)可抑制模型小鼠血管再生[23]。以上觀點(diǎn)認(rèn)為miR-27調(diào)控血管新生，參與血管發(fā)育及損傷修復(fù)過程。miR-27參與T2DM病程進(jìn)展已有已有報(bào)道，研究認(rèn)為miR-27表達(dá)影響T2DM治療及預(yù)后[24]。但對(duì)其在DR發(fā)病中的作用鮮少見報(bào)道。當(dāng)前用于miRNA檢測(cè)方法包括RT-PCR、分子探針技術(shù)、直接測(cè)序法及miRNA芯片微陣列技術(shù)等，其中RT-PCR法因具備更高的靈敏度及特異性廣泛應(yīng)用于miRNA定量測(cè)定[25]。本研究中，所有受試者均采血，應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，DR組、T2DM組血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，支撐Wang等[26]研究觀點(diǎn)，提示miR-27在T2DM及T2DM微血管并發(fā)癥發(fā)病中均有重要作用?？紤]miR-27主要分布于富含血管及細(xì)胞組織內(nèi)，與血管功能及穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)含量較高，主要通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，影響血管穩(wěn)態(tài)及功能，參與血管損傷修復(fù)、新生及老化等病理、生理過程，同時(shí)可通過與靶基因結(jié)合參與血管炎癥反應(yīng)過程[27]；而DR主要以糖尿病微血管病變及視網(wǎng)膜新生血管為特點(diǎn)，miR-27過表達(dá)可促進(jìn)DR新生血管形成，誘導(dǎo)血管生長因子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖，加重血管炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)DR微血管損傷。

圖1 DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量與血清VEGF、空腹血糖、糖化血紅蛋白的相關(guān)性散點(diǎn)圖。

有研究發(fā)現(xiàn)VEGF參與DR發(fā)病及進(jìn)展過程，與DR病情嚴(yán)重程度有關(guān)，PDR患者血清VEGF水平較NPDR高2～3倍左右[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，DR及T2DM患者血清VEGF表達(dá)均較正常人高，同時(shí)DR中PDR患者血清VEGF表達(dá)水平明顯高于NPDR，與上述結(jié)論一致，提示VEGF與DR發(fā)病及進(jìn)展緊密相關(guān)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，DR、T2DM及正常人群中血清VEGF與血漿miR-27表達(dá)趨勢(shì)接近，兩者均與DR空腹血糖、糖化血紅蛋白變化有關(guān)。推測(cè)miR-27可能通過調(diào)控VEGF表達(dá)，參與T2DM微血管病變過程，同時(shí)血糖水平可能直接影響miR-27表達(dá)。糖化血紅蛋白系僅2～3mo內(nèi)血糖控制水平的反饋，前期已明確，血糖控制不佳直接加速DR病情進(jìn)展[30]。糖化血紅蛋白作為晚期糖基化產(chǎn)物之一，其濃度上升、大量沉積直接激活糖基化中膜產(chǎn)物受體表達(dá)，導(dǎo)致氧自由基釋放增多，造成組織缺氧，造成血管通透性提升，介導(dǎo)新生血管生成，加速DR病變及進(jìn)展[31]。而VEGF作為促血管生成的關(guān)鍵因子，直接參與血管通透性調(diào)節(jié)及新生血管生成過程，與T2DM微血管病變及DR病程進(jìn)展有關(guān)[32]。而本研究發(fā)現(xiàn)，以上各因子均影響miR-27表達(dá)，考慮miR-27可能通過糖代謝途徑，影響VEGF合成及表達(dá)，參與DR發(fā)病及病情進(jìn)展過程；T2DM患者長期血糖控制不佳，誘導(dǎo)糖基化終產(chǎn)物釋放及沉積，加重氧化應(yīng)激損傷，而miR-27參與糖異生、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)節(jié)過程，導(dǎo)致機(jī)體糖耐量降低，肝糖異生加強(qiáng)，血葡萄糖濃度上升，導(dǎo)致大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞微粒釋放，進(jìn)一步加重血糖代謝紊亂所致糖尿病微血管病變，造成血管內(nèi)皮功能受損，導(dǎo)致DR發(fā)病及視網(wǎng)膜血管病變進(jìn)展。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，病程、DR分期均為DR患者miR-27表達(dá)影響因素，即病程越長、DR增生性病變?cè)絿?yán)重患者miR-27相對(duì)表達(dá)量更高，考慮隨T2DM患者病程進(jìn)展，微血管糖基化損傷越嚴(yán)重，miR-27表達(dá)量增加，可進(jìn)一步誘導(dǎo)VEGF釋放，促進(jìn)血管生成，增加血管內(nèi)膜通透性，加劇血管壁炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致DR病情進(jìn)展。另外，本研究相關(guān)性分析證實(shí)，miR-27相對(duì)表達(dá)量與DR患者血清VEGF、空腹血糖及糖化血紅蛋白均呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)miR-27可能糖代謝、促VEGF釋放等途徑參與DR發(fā)病及病情進(jìn)展過程，或可能為DR防治的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血漿miR-27相對(duì)表達(dá)量較單純T2DM及正常健康人高，且與DR病情進(jìn)展有關(guān)；T2DM病程、血清VEGF、空腹血糖、糖化血紅蛋白、DR分期均影響DR患者miR-27表達(dá)，且DR患者miR-27相抵表達(dá)量與同VEGF、空腹血糖、糖化血紅蛋白呈正相關(guān)，推測(cè)miR-27可能通過調(diào)控糖代謝、促血管生成等途徑參與DR發(fā)病及進(jìn)展過程，有望作為DR防治研究的新方向。但對(duì)其參與DR發(fā)病的確切機(jī)制及信號(hào)途徑本研究尚未完全明確，有待開展動(dòng)物試驗(yàn)或體外研究證實(shí)。