閆洪洋，黃啟蒙，蔡興華，張立立，徐志強(qiáng)，馬林，李萌

1.中國煙草總公司職工進(jìn)修學(xué)院, 河南 鄭州 450008;

2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 河南 鄭州 450001;

3.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心, 浙江 杭州 310024

0 引言

煙用香料是卷煙生產(chǎn)中必不可少的物質(zhì)，對卷煙的風(fēng)格和品質(zhì)形成有重要影響. 煙用香料主要包括煙草源香料、非煙草來源的天然香料和人工合成香料[1-2]. 然而，天然香料資源有限，難以滿足市場需求；合成香料香氣單一，受合成方法或條件的制約，很多優(yōu)質(zhì)香氣成分尚不能人工合成，或合成成本太高[3-5].

隨著微生物發(fā)酵技術(shù)的不斷發(fā)展，利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備煙用香料成為行業(yè)內(nèi)的研究熱點. 該方法制備的煙用香料具有不受氣候條件限制、生產(chǎn)周期短、對環(huán)境友好等特點[6]. 但是，目前將微生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于煙用香精香料開發(fā)的報道主要集中于陳化后煙葉表面微生物的利用與開發(fā)[7-8]. 呂品等[9]利用由自然陳化的白肋煙葉分離篩選的產(chǎn)香菌發(fā)酵咖啡，定向生產(chǎn)了具有獨特香氣特征的煙用香料，卷煙加香實驗結(jié)果表明：發(fā)酵香料具有提高卷煙煙氣香氣質(zhì)、增大香氣量、降低干燥感和刺激性、柔和煙氣等作用. 庹有朋等[10]應(yīng)用高通量測序分析了陳化煙葉表面微生物種類并從中篩選出優(yōu)勢株菌應(yīng)用于煙葉發(fā)酵，發(fā)酵后煙葉的香氣質(zhì)和香氣量增加，刺激性、雜氣減少，煙葉品質(zhì)明顯提升.

目前，果類微生物在煙用香料制備中的應(yīng)用也有相關(guān)報道，周麗娟等[11]從荔枝中分離得到的內(nèi)生酵母菌能夠發(fā)酵產(chǎn)生苯乙醇、糠醛、2,3-丁二醇等香氣物質(zhì)；朱宇等[12]從西瓜中分離的一株內(nèi)生酵母菌能夠?qū)⒈?、胺、酚等物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成酸、醇等香氣物質(zhì)，將由其發(fā)酵干果提取液制備的香料加入卷煙中，具有柔和煙氣、提高煙氣細(xì)膩性和甜潤感的作用. 郭林青等[13]從巨峰葡萄表皮分離篩選得到一株能夠使煙末發(fā)酵液產(chǎn)生明顯花香韻和甜香韻且區(qū)別于對照組的漢遜酵母菌株YG-4，利用該菌株發(fā)酵制備得到的煙末發(fā)酵液與空白對照組對比，雖然有部分香氣成分含量降低，但是苯乙醇、苯甲醛苯乙酯、2-戊烯酸、1-苯基-3-氨基吡唑含量均有所增加，對于發(fā)酵液香味有所改善，產(chǎn)生不同于空白對照組的特征香氣.

為開發(fā)與以往研究不同的微生物資源，本研究擬從陽光玫瑰葡萄中分離篩選出產(chǎn)香菌株，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定；利用所得菌株發(fā)酵煙末，制備出能夠賦予卷煙獨特風(fēng)格特征的煙用香料，以改善卷煙的吸食品質(zhì)，為生物發(fā)酵技術(shù)在煙用香料開發(fā)中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗原料與試劑

原料：臨滄C3F復(fù)烤煙葉，河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供；陽光玫瑰葡萄，摘自鄭州大學(xué)葡萄園，采集3個樣品用于3次重復(fù)實驗，分別標(biāo)記ZD1、ZD2、ZD3，在無菌條件下收集3個新鮮樣品的葡萄表皮用于實驗.

試劑：Ezup柱式酵母基因組DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限責(zé)任公司產(chǎn).

1.2 主要儀器與設(shè)備

EL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)；HZQ-211C型落地恒溫振蕩器、HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；LX-C35L型壓力蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)；SW-CJ-2D型無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)；SHL-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鄭州凱鵬實驗儀器有限公司產(chǎn)；SHSL型調(diào)溫電熱套，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)；GC6890-5973MSN型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司產(chǎn)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn).

1.3 培養(yǎng)基的配制

YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母浸粉1 g，葡萄糖2 g，瓊脂粉2 g，蒸餾水定容至100 mL，于115 ℃下高溫高壓滅菌30 min.

WL鑒定培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g、蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.55 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.002 5 g、硫酸錳0.025 g、溴甲酚綠0.022 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL，于115 ℃下高溫高壓滅菌30 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：煙末(C3F復(fù)烤煙葉經(jīng)粉碎打末)10 g，蒸餾水100 mL，于115 ℃下高溫高壓滅菌30 min.

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的富集、分離及純化參考張俊杰等[14]的研究方法，簡述如下：在無菌條件下，分別取1 g葡萄果皮樣品加入到99 mL無菌液體YEPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取出靜置，將富集液進(jìn)行梯度稀釋至10-5. 分別選取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液均勻涂布至固體YEPD培養(yǎng)基，在30 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d至長出單菌落. 采用平板劃線法純化菌株，編號保存.

1.4.2 產(chǎn)香菌株的篩選將保存的菌株接種至液體YEPD培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察并記錄發(fā)酵液香味變化，通過嗅辨分析將產(chǎn)生令人愉悅香氣的菌株培養(yǎng)液取出、標(biāo)記，并編號保存[15]. 方法簡述如下：按1∶10(體積比)接種量將保存菌株接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1～2 d，制得發(fā)酵液. 同時，同比例接種無菌水到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，作為空白對照組，并設(shè)置3組平行實驗. 根據(jù)感官嗅辨結(jié)果，選出產(chǎn)香效果較好的菌株，將明顯區(qū)別于對照組香味的發(fā)酵液取出、標(biāo)記. 對篩選得到的最優(yōu)菌株，重復(fù)上述步驟制備發(fā)酵液，并設(shè)置空白對照組，進(jìn)行菌株的鑒定及發(fā)酵液致香成分分析.

1.4.3 產(chǎn)香菌株的鑒定1)形態(tài)學(xué)鑒定. 將篩選得到的菌株接入WL鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行菌落形態(tài)觀察：從菌落的顏色、質(zhì)地、表面、菌落形態(tài)等特征進(jìn)行描述，對酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)方面的初步分類. 細(xì)胞顯微形態(tài)觀察：從細(xì)胞形狀、細(xì)胞生殖方式和細(xì)胞為單生、對生或群生3個方面對篩選菌株進(jìn)行描述[13,16].

2)分子生物學(xué)鑒定. 用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行5.8 S-ITS區(qū)基因擴(kuò)增[17-18]. 對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，并用MEGA7軟件進(jìn)行分析，確定該酵母菌株的分類地位[19-22].

1.4.4 發(fā)酵液致香成分的測定樣品前處理：將供試菌株種子液按1∶10的體積比接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，將煙末發(fā)酵液置于同時蒸餾萃取裝置一端的圓底燒瓶中，加入25 g氯化鈉，溶解于100 mL蒸餾水，用電熱套加熱；裝置的另一端為盛有60 mL二氯甲烷.二氯甲烷萃取液加入適量的無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，置于4 ℃過夜的500 mL圓底燒瓶，在60 ℃下水浴加熱，同時蒸餾萃取3 h. 過濾，加入1 mL乙酸苯乙酯作為定量分析的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，將濾液減壓濃縮至1 mL，待測. 每個樣品做3次重復(fù)實驗.

GC測試條件：毛細(xì)管柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣溫度240 ℃；載氣He，流速1.0 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1 μL；升溫程序50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min速度上升到280 ℃，保持10 min，結(jié)束. MS測試條件：傳輸線溫度280 ℃；EI電子能量70 eV；倍增器電壓1450 V；質(zhì)量掃描范圍35～550 amu；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃.

采用NIST14.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將檢測出的化合物的結(jié)構(gòu)特征與圖譜進(jìn)行比對，并采用峰面積歸一化法定量計算煙末發(fā)酵液中主要特征香氣成分的含量.實驗設(shè)置3次重復(fù).

1.4.5 煙用香料的制備將供試菌株種子液按1∶10的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下置于搖床發(fā)酵2 d，制備發(fā)酵液. 同時，同比例接種無菌水到發(fā)酵培養(yǎng)基，作為空白對照組.發(fā)酵結(jié)束后，在發(fā)酵液中加入2倍量體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇加熱回流提取，重復(fù)操作，收集兩次的提取液，過濾，濾液靜置后取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(60 ℃)蒸餾除去乙醇，制得煙用香料.

1.4.6 卷煙加香評價按煙絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.05%、0.10%、0.15%稱取煙用香料，用5 mL純凈水溶解后用微量噴霧器均勻地噴加于100 g煙絲上，以純凈水為空白對照，均置于溫度(22±1) ℃和相對濕度(60±2)%環(huán)境中平衡48 h，制成卷煙.采用整體循環(huán)法，經(jīng)專業(yè)評吸小組對上述卷煙進(jìn)行感官綜合描述，感官評吸按照卷煙感官品質(zhì)評判標(biāo)準(zhǔn)，以香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、勁頭、余味為主要指標(biāo)進(jìn)行判斷[23].

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

本研究從陽光玫瑰葡萄果皮表面共分離得到23株酵母菌，通過嗅辨評定，所得發(fā)酵液與空白組進(jìn)行對照，僅菌株MG6發(fā)酵液具有濃郁的果香味，并略帶酒香氣息.

2.2 產(chǎn)香菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定MG6在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征如圖1和圖2所示. 由圖1可知，產(chǎn)香菌株MG6在WL培養(yǎng)基上，菌落顏色呈白色邊、淺綠色頂，菌落形態(tài)均為中部凸起、表面褶皺、無光澤、干燥、不透明、邊緣不規(guī)則. 由圖2可知，在顯微鏡下，MG6菌株細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形，單生，單端芽殖.

圖1 MG6在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony morphology of MG6 on WL medium

圖2 MG6的顯微形態(tài)特征Fig.2 Micromorphological characteristics of MG6

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定菌株MG6的5.8S-ITS擴(kuò)增電泳圖如圖3所示. 由圖3可知，MG6菌株的5.8S-ITS序列PCR產(chǎn)物電泳條帶明亮清晰且無拖帶現(xiàn)象，序列長度在400 bp左右，符合測序要求.

圖3 菌株MG6的5.8S-ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.3 PCR product of 5.8S-ITS of strain MG6

將測序得到的基因序列經(jīng)過修正后提交到Genebank,并利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具進(jìn)行序列比對.利用Mega 7.0軟件，用K2+G模型進(jìn)行Maximum Likehood(ML)聚樹及系統(tǒng)發(fā)育分析，基于5.8S-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示. 由圖4可知，菌株MG6與Pichiaterricola、Issatchenkiaterricola聚為同一分支，遺傳相似性為100 %. 多重序列分析已將伊薩酵母屬(Issatchenkia)歸入畢赤酵母屬(Pichia)[24-26]，可將Pichiaterricola和Issatchenkiaterricola認(rèn)定為同一種菌，即陸生畢赤酵母(Pichiaterricola)[27]. 因此，確定菌株MG6為Pichiaterricola.

圖4 基于5.8S-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS sequences

2.3 發(fā)酵液致香成分分析結(jié)果

發(fā)酵液致香成分分析結(jié)果見表1. 由表1可知，發(fā)酵組與對照組共檢測出致香成分48種，主要由酮類、醇類、酯類、酚類、烯烴類、雜環(huán)類組成. 其中對照組共檢測出32種致香成分，發(fā)酵組檢測出38種致香成分. 對比分析可得，發(fā)酵組酮類、醇類、酯類、酚類、烯烴類、雜環(huán)類致香成分含量相比對照組均有所增加，其中酮類致香成分增加了63.59%，醇類致香成分增加了102.28%，酯類致香成分增加了125.50%，酚類致香成分增加了77.05%，烯烴類致香成分增加了35.25%，雜環(huán)類致香成分增加了59.71%. 其中，大馬士酮、巨豆三烯-3-酮、法尼基丙酮、苯甲醇、苯乙醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯酚、愈創(chuàng)木酚、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、新植二烯、吡啶等致香成分均有不同程度的提高.

表1 發(fā)酵液致香成分分析Table 1 Analysis of aroma components of fermentation broth

煙葉中常見的致香成分有巨豆三烯-3-酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、新植二烯等. 其中，巨豆三烯-3-酮可有效改善煙氣，增加舒適度，其增加了25.60%；二氫獼猴桃內(nèi)酯具有獼猴桃樣的青香果香，賦予卷煙煙氣清甜味，其增加了33.07%；新植二烯能明顯降低煙草刺激性、提高烤煙豐滿度，其增加了32.33%. 綜上所述，經(jīng)產(chǎn)香菌株MG6發(fā)酵后，各類特征香氣成分含量均明顯增加，這對提高煙葉整體感官品質(zhì)起到了重要作用.

2.4 卷煙加香評價結(jié)果

卷煙加香評價結(jié)果如表2所示. 由表2可知，加入適量的煙用香料，可以提高卷煙的香氣質(zhì)、香氣量，降低刺激性，減少雜氣，并使煙氣柔和，改善余味. 但是，香料添加量過大會使卷煙的整體感官品質(zhì)降低. 綜合考慮，香料最佳添加量為0.05%.

3 結(jié)論

本研究從陽光玫瑰葡萄表皮中分離出一株能夠?qū)熑~產(chǎn)香的菌株MG6，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為Pichiaterricola. 利用GC-MS技術(shù)對其發(fā)酵液進(jìn)行分析，結(jié)果表明發(fā)酵后酮類、醇類、酯類等煙葉特征香氣成分含量均有不同程度的增加. 利用該菌株發(fā)酵液制備煙用香料，適量添加(添加量為0.05 %)可使卷煙香氣質(zhì)、香氣量得到提升，刺激性、雜氣降低，煙氣柔和，改善了卷煙的吸食品質(zhì).

本文開發(fā)出與以往研究不同的一種新的微生物資源，并將其運(yùn)用到煙葉發(fā)酵中，這對提高煙葉工業(yè)可用性具有重要意義；同時可為煙用香精香料產(chǎn)品的開發(fā)，以及生產(chǎn)特色的煙用加香原料提供一種新的思路和方法.