胡曉龍，田瑞杰，張勇，余苗，何培新，李華，李明笑，孫繼祥

1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475001；

2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；

3.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后科研工作站，河南 澠池 472400；

4.河南省食品檢驗研究院，河南 鄭州 450000；

5.河南皇溝酒業(yè)有限責(zé)任公司，河南 永城 476600

0 引言

窖泥作為特殊的土壤樣品，是濃香型白酒釀造的主要微生物來源之一[1]，其品質(zhì)是影響白酒品質(zhì)的重要因素[2-4].窖泥理化性質(zhì)對白酒相關(guān)微生物的生長繁殖具有重要影響[2,5-6].適宜的含水量能保障窖泥中微生物必要的生理代謝正常進(jìn)行,若含水量過低，窖泥會出現(xiàn)不同程度的板結(jié)現(xiàn)象，造成微生物生長繁殖困難[7].窖泥pH值過低會影響微生物細(xì)胞膜的電荷變化，抑制窖泥微生物的代謝[8].銨態(tài)氮含量過少易導(dǎo)致窖泥營養(yǎng)匱乏，微生物生長受到抑制；銨態(tài)氮含量過剩則易導(dǎo)致窖泥臭味明顯[9].磷元素是微生物的重要組成成分，也是微生物生長代謝中不可缺少的元素之一，其中有效磷是水溶性、有機(jī)態(tài)的易被微生物直接吸收和利用的磷.研究表明[3]，窖泥中的有效磷含量與窖泥細(xì)菌總量呈正相關(guān).總酸對窖泥中的己酸菌、丁酸菌等有益微生物的生長代謝活動影響較大，發(fā)酵過程中酸度偏大會導(dǎo)致窖泥老化[10].胡曉龍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，總酸是影響窖泥優(yōu)勢菌群的主要理化因子之一.因此，明晰窖泥的理化性質(zhì)有助于指導(dǎo)制備人工優(yōu)質(zhì)窖泥、建立窖泥品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定濃香型白酒的品質(zhì)等[1].

窖泥理化性質(zhì)與其所處地理位置具有一定關(guān)聯(lián)性[12-13].黃治國等[12]比較了宜賓、瀘州和邛崍3個地區(qū)窖泥的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)宜賓和邛崍的窖泥pH值及水分、腐殖酸和有效磷含量均顯著低于瀘州窖泥，而邛崍窖泥的總糖和總酸含量則相對高于宜賓和瀘州的窖泥.此外，窖泥理化性質(zhì)是除感官和微生物指標(biāo)以外評價窖泥品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[7]，包括pH值,水分含量,無機(jī)鹽氮含量、磷含量、鉀含量,腐殖質(zhì)含量等[14].李學(xué)思等[15]研究發(fā)現(xiàn)，宋河酒業(yè)的窖泥水分、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量均隨窖齡的增加而不斷增加，在窖齡3～15 a內(nèi)，隨著窖齡的增加，窖泥pH值、有效磷和鈣含量先增加后減小，銨態(tài)氮含量總體呈增加的趨勢，具體表現(xiàn)為先增加后減少再增加的趨勢.胡曉龍[2]研究了江蘇某酒企不同品質(zhì)的窖泥，發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)窖泥的水分含量(31.07%)低于退化窖泥(36.90%)，但優(yōu)質(zhì)窖泥的pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量、有效磷含量等均高于退化窖泥.張勝利等[16]研究發(fā)現(xiàn)，品質(zhì)較好的窖泥pH值應(yīng)為4.8～7.0，優(yōu)質(zhì)窖泥最佳pH值約為5.0.張良等[5]研究發(fā)現(xiàn)，窖泥中的礦物元素鋅、錳、鈣有利于改善窖泥品質(zhì).窖泥中的腐殖質(zhì)具有良好的保水作用，可緩解乳酸鈣、乳酸鐵的形成，避免窖泥板結(jié)退化[1,7].在諸多理化因子中，總氮含量、銨態(tài)氮含量和pH值可作為綜合指標(biāo)初步判定窖泥品質(zhì)，且與窖泥品質(zhì)呈正相關(guān)[6].盡管四川、江蘇等濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)窖泥理化性質(zhì)及其與地域、品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性已有較多研究成果[2,12-13,17]，但河南作為我國北方濃香型白酒釀造主產(chǎn)區(qū)之一，尚未見其窖泥理化性質(zhì)地域特征的研究報道.

基于此，本研究擬解析河南省5個地域(豫東、豫西、豫南、豫北及豫中)6家酒企窖泥樣品的理化因子，以期進(jìn)一步豐富我國窖泥理化性質(zhì)的地域特征，為河南酒企窖泥的科學(xué)養(yǎng)護(hù)和調(diào)控提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑重鉻酸鉀、酒石酸銻鉀、亞硝基鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、NaOH、高氯酸鈉、酒石酸鉀鈉、濃H2SO4、HCl、硼酸、NH3Cl、鉬酸銨、氟化銨、酚酞等，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn).

1.1.2 主要儀器與設(shè)備PB-10 型pH計，德國Sartorius公司產(chǎn)；UV BlueStar A型紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司產(chǎn)；DF-1型集熱式恒溫磁力攪拌鍋，金壇市中大儀器廠產(chǎn)；MP200A型精密電子天平，上海良豐儀器儀表有限公司產(chǎn)；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥樣品采集窖泥樣品采集自河南省6家代表性酒企的窖齡大于10 a的老窖池，其相關(guān)信息分別為：豫東(HG酒企：窖齡35 a，E115°58′～116°39′，N33°42′～34°18′；SH酒企：窖齡15 a，E115°13′20″,N33°46′50″)、豫西(YS酒企：窖齡30 a，E111°33′～112°01′，N34°36′～35°05′)、豫北(BQC酒企：窖齡12 a，E113°20′～113°57′，N35°17′～35°50′)、豫南(WGC酒企：窖齡35 a，E115°41′，N32°44′)和豫中(JH酒企：窖齡40 a，E113°21′15″～113°44′53″，N33°7′50″～33°30′22″).

每家酒企均隨機(jī)選取兩口正常使用的窖池.每口窖池共取4個代表樣品，取樣位置如圖1所示，其中窖壁上層T1和T2混合樣(PT)、窖壁中層M1和M2混合樣(PM)、窖壁下層U1和U2混合樣(PU)、窖底B1和B2混合樣(PB)各1個，每個混合樣約500 g，共計48個窖泥樣品，于-20 ℃貯存?zhèn)溆?

圖1 窖池中窖泥的取樣位置示意圖Fig.1 The schematic dragram of the sampling location of the pit mud in the pit

1.2.2 理化指標(biāo)測定采用烘干法和電位法分別測定窖泥水分含量及pH值[18].采用酸堿中和滴定法測定窖泥總酸含量[19].參照NY/T1121.7—2014測定窖泥有效磷含量[20].采用靛酚藍(lán)比色法測定窖泥銨態(tài)氮含量[21].

1.2.3 數(shù)據(jù)分析采用軟件IBM SPSS Statistics 20中的雙變量Pearson相關(guān)性功能條目和軟件Canoco 5分別對窖泥理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性和主成分分析(Principal Componet Analysis, PCA).

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥總體理化性質(zhì)分析

6家酒企窖泥的理化指標(biāo)測定結(jié)果見圖2,其中不同小寫字母表示具有顯著差異(P<0.05).由圖2a)可以看出，6家酒企窖泥的平均水分含量、pH值、總酸、銨態(tài)氮和有效磷含量分別為39.21%、5.36、7.51 mg/g、699.0 mg/kg和214.7 mg/kg.本研究中窖泥的平均水分含量與四川某酒企一級窖泥[6]、瀘州窖泥[12]、宜賓窖泥[12]等的水分含量(40%)相近.河南產(chǎn)區(qū)平均pH值與湖南產(chǎn)區(qū)(5.1)[4]、宜賓產(chǎn)區(qū)(4.0～6.0)[13]、貴州產(chǎn)區(qū)(5.64)[22]相近；但與江蘇產(chǎn)區(qū)某酒企窖泥相比，河南產(chǎn)區(qū)最大pH值(8.79)高于其優(yōu)質(zhì)窖泥pH值(7.61)，最低pH值(3.53)低于其退化窖泥pH值(4.57)[2].

2.2 窖泥水分含量變化規(guī)律分析

6家酒企窖泥的水分含量范圍為27.24%～51.21%.由圖2b)可以看出，SH窖泥的平均水分含量(47.94%)顯著高于其他5家酒企(P<0.05)；其次是HG、YS和JH窖泥，平均水分含量分別為39.61%、39.63%和40.65%；WGC和BQC窖泥的平均水分含量最低，分別為32.66%和34.76%，顯著低于其他4家酒企(P<0.05).從空間分布來看，豫東SH和HG、豫中JH、豫西YS窖泥的平均水分含量從東到西呈降低的趨勢，豫南WGC和豫北BQC窖泥的平均水分含量均在32.00%～35.00%之間，顯著低于豫中JH窖泥.窖泥是一類特殊的土壤物質(zhì)，其水分含量在河南地域內(nèi)具有明顯的空間分布特征，表現(xiàn)為“南北低，東西和中部高”，這可能與酒企所處位置的地勢(海拔高度、地下水深度、離地上水系的距離等)有關(guān)，并受白酒釀造工藝、窖池窖齡、窖池空間位置等的影響.

圖2 6家酒企窖泥的理化指標(biāo)測定結(jié)果Fig.2 Physical and chemical properties of pit mud collected from six Baijiu production companies of He′nan province

2.3 窖泥pH值變化規(guī)律分析

6家酒企窖泥的pH值范圍為3.53～8.79.由圖2c)可以看出，河南不同地區(qū)酒企窖泥的平均pH值呈“中部高，周邊低”的分布特征：中部地區(qū)HG和JH窖泥的平均pH值最高，分別為6.44和8.15，顯著高于其他4家酒企窖泥樣品(P<0.05);SH、YS、WGC和BQC窖泥的平均pH值均較低，分別為4.87、4.30、4.38和4.00.從6家酒企的地理位置可知，以豫中JH為分界點，從南到北、從東到西均呈低、高、低的變化趨勢；豫南WGC與豫北BQC窖泥的平均pH值變化不顯著，但與豫中JH窖泥存在顯著差異.相關(guān)研究表明[23]，pH值與窖泥的多項指標(biāo)密切相關(guān)，如pH值能影響窖泥細(xì)菌總量，還能影響窖泥功能菌群梭菌綱細(xì)菌的生長繁殖，當(dāng)pH值低于4.0時，不利于產(chǎn)己酸菌株生產(chǎn)己酸，而己酸是濃香型白酒重要香味成分己酸乙酯重要的前體物質(zhì)[13].豫南WGC和豫北BQC窖泥的平均pH值與宜賓和邛崍產(chǎn)區(qū)窖泥的平均pH值接近[12].

2.4 窖泥總酸含量變化規(guī)律分析

6家酒企窖泥的總酸含量范圍為0.16～18.18 mg/g，由圖2d)可以看出，各酒企的平均總酸含量為6.87 mg/g(SH)、3.41 mg/g(HG)、13.74 mg/g(YS)、0.56 mg/g(JH)、7.30 mg/g(WGC)和13.19 mg/g(BQC).對比圖2c)和d)發(fā)現(xiàn)，窖泥總酸含量與其pH值呈負(fù)相關(guān).例如，HG和JH窖泥的平均總酸含量顯著偏低(P<0.05)，而其平均pH值顯著偏高；SH、YS、WGC和BQC窖泥的平均總酸含量顯著高于HG和JH窖泥，而這4家酒企窖泥的pH值均顯著偏低.綜上可知，河南產(chǎn)區(qū)窖泥總酸含量具有“中部低，周邊高”的分布特征.窖泥中的總酸主要為乳酸，其次是己酸、丁酸等有機(jī)酸[24].適量的有機(jī)酸有利于酒體風(fēng)味的形成，但過量的有機(jī)酸易導(dǎo)致窖泥生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡，不利于窖泥菌群的穩(wěn)定[2,24].

2.5 窖泥銨態(tài)氮含量變化規(guī)律分析

6家酒企窖泥的銨態(tài)氮含量范圍為8.2～2 118.0 mg/kg.由圖2e)可以看出，BQC窖泥的平均銨態(tài)氮含量最低(124.4 mg/kg)，JH窖泥的平均銨態(tài)氮含量最高(1 621.8 mg/kg).南北地區(qū)兩家酒企(WGC和BQC)窖泥的平均銨態(tài)氮含量具有顯著差異(P<0.05)；東西方向3家酒企，豫東SH和HG與豫西YS窖泥的平均銨態(tài)氮含量均具有顯著差異；豫中JH窖泥的平均銨態(tài)氮含量顯著高于其他5家酒企(P<0.05).YS和BQC窖泥的平均銨態(tài)氮含量均顯著較低，在地理分布上，這兩家酒企均地處黃河以北.受黃河來水來沙、尾閭流路變遷、全球氣候變化等自然因素，以及農(nóng)業(yè)耕種熟化、城鎮(zhèn)化、工業(yè)化等人類活動的交互作用和疊加影響，黃河南北流域及上下游地域化學(xué)特征有機(jī)質(zhì)、氮、磷等均存在一定差異，因此，黃河流域相同區(qū)位在理化性質(zhì)上可能具有一定共性[25].銨態(tài)氮是無機(jī)氮源，為窖泥微生物生長繁殖提供氮元素，有利于窖泥微生物的生長繁殖[26].與國內(nèi)其他酒企窖泥的銨態(tài)氮含量相比，宜賓產(chǎn)區(qū)窖泥銨態(tài)氮含量多為400.0～600.0 mg/kg[13]，安徽某酒企窖泥的銨態(tài)氮含量最高為308.0 mg/kg，最低為98.7 mg/kg[24]，而河南酒企除SH和JH窖泥銨態(tài)氮含量略高外，另外4家酒企與其他省份部分酒企窖泥的銨態(tài)氮含量基本一致.

2.6 窖泥有效磷含量變化規(guī)律分析

磷元素是微生物細(xì)胞的重要組成成分，微生物死亡沉積后，細(xì)胞分解物導(dǎo)致磷元素含量增加[28]，這對調(diào)控窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與活力具有指導(dǎo)意義.6家酒企窖泥的有效磷含量范圍為36.3～535.7 mg/kg.由圖2f)可以看出，SH窖泥的平均有效磷含量最低(106.1 mg/kg)，YS窖泥的平均有效磷含量最高(356.0 mg/kg).

2.7 酒企地理位置對窖泥理化性質(zhì)的影響分析

上述研究結(jié)果初步表明，窖泥理化性質(zhì)受所在酒企地理位置的影響.6家河南酒企老窖泥的PCA分析如圖3所示，其中綠、紅、黃和紫色分別代表相應(yīng)酒企窖池上、中、下和底層的窖泥樣品.由圖3可以看出，老窖泥(>10 a)在PCA圖中的分布具有明顯的地域性，即不同地域酒企的老窖泥能很好地被區(qū)分開，而來源于同一酒企不同窖池空間位置的窖泥能很好地聚類.同時，豫東與豫中3家酒企分布于Axis1軸中心垂直線左側(cè)，豫北與豫西兩家酒企分布于Axis1軸右側(cè)，豫南酒企基本位于Axis1中軸線上，再次表明老窖泥的理化性質(zhì)主要受其所處地理位置的影響.兩個主成分解釋了窖泥分布90.16%的信息，其中PC1解釋了76.67%，說明PC1是區(qū)分各酒企老窖泥分布的主要因素.其中pH值、水分含量、銨態(tài)氮含量和總酸含量與PC1軸夾角很小，說明其對PC1貢獻(xiàn)較大[2].有效磷含量與PC2軸夾角很小，說明其對PC2成分貢獻(xiàn)較大，其中豫西YS窖泥的有效磷含量高于豫北BQC窖泥.綜上可知，在整個河南省范圍內(nèi)，窖泥的理化性質(zhì)受酒企所在地理位置的影響較大，且大于窖泥空間位置對其理化性質(zhì)的影響程度.

圖3 6家河南酒企老窖泥的PCA分析Fig.3 PCA analysis of old pit mud from six Baijiu production companies of He′nan province

2.8 窖泥理化因子之間的關(guān)聯(lián)性分析

分析6家酒企48個窖泥樣品的理化因子之間存在的關(guān)聯(lián)性，可為尋找能反映窖泥理化性質(zhì)的綜合理化指標(biāo)提供理論基礎(chǔ).窖泥理化因子之間的Pearson相關(guān)性見表1.由表1可知，除有效磷含量外，窖泥銨態(tài)氮含量與其他3種理化因子之間存在顯著正或負(fù)相關(guān)；pH值與總酸含量和銨態(tài)氮含量之間均存在顯著相關(guān)性，其中pH值與總酸含量的相關(guān)性最高.據(jù)報道[26,28]，pH值和銨態(tài)氮含量與微生物數(shù)量及多樣性存在顯著相關(guān)性，pH值會影響窖泥整個微生物群落多樣性及其組成[28].在不同品質(zhì)窖泥的理化性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，pH值與窖泥的水分含量、銨態(tài)氮含量、有效磷含量、可溶性有機(jī)碳含量等均呈顯著相關(guān)性[2].在對土壤樣品理化因子相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，pH值與堿解氮含量、有效磷含量的相關(guān)性顯著[29].本研究中，pH值僅與總酸含量和銨態(tài)氮含量呈顯著相關(guān)性，而銨態(tài)氮含量與水分含量、總酸含量和pH值均呈顯著相關(guān)性.因此本研究中pH值和銨態(tài)氮含量這兩種因子可以被推薦作為初步反映窖泥綜合理化性質(zhì)的指標(biāo)，這與土壤pH值影響其他理化指標(biāo)呈現(xiàn)明顯相關(guān)性的結(jié)論一致[30]，但由于窖泥是一種復(fù)雜的生態(tài)體系，除理化性質(zhì)外，微生物等因素均能影響窖泥的微生態(tài)平衡及品質(zhì)，因此，用pH值和銨態(tài)氮含量去評價窖泥品質(zhì)還不夠全面，需進(jìn)一步完善評價標(biāo)準(zhǔn).

表1 窖泥理化因子之間的Pearson相關(guān)性Table 1 The Pearson relationships between biogeochemical attributes of pit muds

3 結(jié)論

本文對河南6家具有代表性的酒企窖泥進(jìn)行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，河南酒企窖泥的常規(guī)理化指標(biāo)平均水分含量、pH值、總酸含量、銨態(tài)氮含量和有效磷含量分別為39.21%、5.36、7.51 mg/g、699.0 mg/kg和214.7 mg/kg；在河南范圍內(nèi)，窖泥平均水分含量呈現(xiàn)“南北低，東西和中部高”的分布特征，平均pH值呈現(xiàn)“中間高，周邊低”的分布特征，平均總酸含量變化趨勢與pH值變化趨勢相反，中部地區(qū)酒企的平均銨態(tài)氮含量最高(1 621.8 mg/kg)，西部地區(qū)酒企的平均有效磷含量最高(356.0 mg/kg).主成分分析顯示窖泥地理位置分布特征與窖泥pH值、水分含量、銨態(tài)氮含量和總酸含量存在較高的相關(guān)性，表明其可能是區(qū)分窖泥地理分布特征的主要環(huán)境因子.理化因子Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮含量與含水量、pH值呈顯著正相關(guān)，與總酸含量則呈顯著負(fù)相關(guān)，總酸含量與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān).

本研究在一定程度上豐富了人們對河南產(chǎn)區(qū)窖泥理化特性的認(rèn)識，證實了窖泥理化因子具有地域分布特征，對進(jìn)一步探究不同地域窖泥理化因子與微生物菌群之間的相關(guān)性等具有一定的積極作用.由于本文窖泥樣品數(shù)量受限，因此后續(xù)研究將增加所選酒企及跨地域窖池的數(shù)量，進(jìn)一步檢驗和完善相關(guān)研究結(jié)果.