蔚慧欣,韓英,楊波

(山西杏花村汾酒廠股份有限公司 技術(shù)中心,山西 汾陽,032205)

我國傳統(tǒng)的白酒釀造工藝中,釀酒微生物參與酒精及其香味物質(zhì)的形成,賦予白酒特有的風(fēng)味[1]。雖然白酒產(chǎn)量一直處于高速發(fā)展階段,但名優(yōu)白酒釀造受到嚴(yán)苛的釀造環(huán)境制約,優(yōu)質(zhì)酒的供需矛盾反而越來越尖銳。目前,提出了白酒生態(tài)發(fā)酵技術(shù),通過重視微生態(tài)系統(tǒng)建立起完善的科學(xué)理論體系,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)以質(zhì)能提升代替量能提升[2]。

白酒中含有大量潛在的小分子生物活性物質(zhì),其中短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)在白酒中含量較高,對(duì)發(fā)酵酒醅酸度的變化起主要貢獻(xiàn),乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs與多種醇類形成的酯類是白酒典型風(fēng)味形成的關(guān)鍵。同時(shí),對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)對(duì)人體健康具有重要意義[3-5],與酒精性肝臟疾病進(jìn)程聯(lián)系密切。研究表明,SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸)在低濃度時(shí)有一定的抗炎作用,揭示了酒類、醋類的保健作用[6-8]。因此研究SCFAs在清香型白酒中的含量變化本身具有意義。

清香型白酒地缸發(fā)酵過程中核心微生物菌群易受溫度、酸度、原料等外界環(huán)境因素的影響,進(jìn)而影響酒體的風(fēng)味與品質(zhì)[9]。每年9月初立醅,開始新一輪的生產(chǎn),在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)該時(shí)期出酒率正常,但原酒中存在總酸、總酯的含量較低等問題。夏季挑醅期氣溫升高,細(xì)菌生長旺盛,導(dǎo)致酒醅升酸高但出酒率低,酒體易出現(xiàn)酸高,乳酸乙酯與乙酸乙酯比例不協(xié)調(diào)現(xiàn)象。解決這一系列問題需要從不同產(chǎn)酸環(huán)境著手研究。近年來,對(duì)清香型白酒不同生產(chǎn)周期的研究開始有報(bào)道,如對(duì)汾酒立醅與圓排期釀酒過程微生物群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)的研究,結(jié)果表明耐酸乳桿菌的缺失是造成兩時(shí)期發(fā)酵差異的主要因素[10]。從四季發(fā)酵過程微生物菌群與風(fēng)味代謝差異中,找到關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[11]。

但對(duì)于立醅與挑醅期的對(duì)比鮮見有相關(guān)研究。本文以解決生產(chǎn)中的實(shí)際問題為切入點(diǎn),通過監(jiān)測(cè)立醅及挑醅生產(chǎn)環(huán)境中的產(chǎn)酸微生物及與產(chǎn)酸直接相關(guān)的SCFAs動(dòng)態(tài)變化,揭示兩個(gè)時(shí)期發(fā)酵過程在產(chǎn)酸方面的顯著性差異,對(duì)科學(xué)把控發(fā)酵進(jìn)程和發(fā)酵工藝現(xiàn)代化升級(jí)改造具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

發(fā)酵過程酒醅樣品取樣于山西杏花村汾酒廠股份有限公司,采樣時(shí)間點(diǎn)為大茬發(fā)酵0、7、15、28 d,選擇全廠有代表行的4個(gè)車間的4個(gè)班組作為平行樣品,每個(gè)酒醅樣品300 g。樣品挖取地缸表面中心向下30 cm處各3個(gè),共120個(gè)樣品。用無菌袋采樣后迅速放置冰盒內(nèi),取樣時(shí)間與樣品處理時(shí)間隔不超過20 min。

酒體取樣于對(duì)應(yīng)4個(gè)車間的大茬蒸餾后的原酒,共8個(gè)。

1.2 主要試劑與儀器

MRS培養(yǎng)基，索萊寶；兩性霉素，VWR Life Science；冰乙酸(≥98.0%)、乳酸(≥90.0%)、無水乙醇(≥99.5%)，國藥。

標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸乙酯(GC-MS級(jí))，Merck；乙酸(≥99.5%)、異丁酸(>99.0%)、磷酸，國藥；丙酸(>99.0%)、丁酸(>99.0%)、戊酸(>98.0%)、異戊酸(>99.0%)，TCI；己酸(≥99.5%)、異己酸(98%)，阿拉丁。

Agilent 7890A/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent DB-WAX 毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm ID×0.25 μm，安捷倫；WT3003N 電子天平，奧豪斯；QL-866渦旋儀，賽洛捷克；H1650-W冷凍離心機(jī)，湖南湘儀；LT-36VLC8人工氣候生長培養(yǎng)箱，PERCIVAL；ZHJH-C1109C超凈工作臺(tái)，上海智誠；MAC-350P高壓滅菌鍋，日本SANYO；Milli Q Plus超級(jí)純水儀，Bio-Rad；WP750中型機(jī)械微波爐，廣東格蘭仕；LQ-300DE超聲波清洗機(jī)，昆山舒美。

1.4 酒醅產(chǎn)酸菌培養(yǎng)方法

1.4.1 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基+兩性霉素(乳酸菌)[12]：胰蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母提取物5 g,K2HPO42 g,檸檬酸二銨2 g,乙酸鈉5 g,葡萄糖20 g,吐溫80 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,蒸餾水1 L,調(diào)pH至6.2～6.4,121 ℃滅菌15 min。

1.4.2 酒醅樣品產(chǎn)酸菌的分離培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

取10 g酒醅樣品溶于90 mL無菌水中,充分混勻,形成10-1的菌懸液,作為原液。依次10倍稀釋,制成6個(gè)梯度的懸濁液,分別吸取100 μl涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基中,做3組平行。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d后取出,計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

每克樣品中乳酸菌數(shù)=同一稀釋度3個(gè)培養(yǎng)皿的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

1.5 短鏈脂肪酸檢測(cè)

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

稱量乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸標(biāo)準(zhǔn)品,用乙酸乙酯配制成0.1,0.5,1,5,10,20,50,100 μg/mL八個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度梯度。取600 μL標(biāo)準(zhǔn)品,加入25 μL終濃度為500 μmol/mL的4-甲基戊酸作為內(nèi)標(biāo),混勻加入進(jìn)樣瓶,進(jìn)行GC-MS檢測(cè),進(jìn)樣量1 μL,分流比10∶1,分流進(jìn)樣。

1.5.2 代謝物提取

將樣品冰上解凍,取 200 mg樣品于2 mL玻璃離心管中。加入900 μL 0.5%的磷酸重懸,振蕩混勻2 min；14 000×g離心10 min,取上清液800 μL,加入等量的乙酸乙酯提取,振蕩混勻2 min,14 000×g離心10 min；取600 μL上層有機(jī)相,加入終濃度為500 μmol/L的4-甲基戊酸作為內(nèi)標(biāo),混勻加入進(jìn)樣瓶,進(jìn)行GC-MS檢測(cè),進(jìn)樣量1 μL,分流比10∶1,分流進(jìn)樣。

1.5.3 色譜-質(zhì)譜分析

氣相色譜條件：樣品采用Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱氣相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。程序升溫：初始溫度90 ℃；以10 ℃/min升溫至120 ℃；再以5 ℃/min升溫至150 ℃；最后以25 ℃/min升溫至250 ℃,并維持2 min。載氣為氦氣,載氣流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜分析：采用Agilent 7890A/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)樣口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃,四極桿溫度150 ℃。電子轟擊電離(EI)源,全掃及SIM掃描方式,電子能量70 eV。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理

采用MSD ChemStation軟件提取色譜峰面積及保留時(shí)間。繪制標(biāo)曲曲線,計(jì)算樣品中SCFAs的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 立醅與挑醅期發(fā)酵酒醅樣品酸度變化

酸度檢測(cè)采用堿式滴定法,結(jié)果如圖1所示。從4個(gè)車間立醅、挑醅發(fā)酵過程均值水平酸度曲線圖可知,挑醅期整個(gè)發(fā)酵期產(chǎn)酸高于立醅期,隨發(fā)酵進(jìn)程酸度遞增；立醅期入缸后酸度更低,隨發(fā)酵進(jìn)行至7對(duì)(即7天,下同)時(shí)，兩時(shí)期以相同的增長速度均呈上升趨勢(shì),而在7對(duì)時(shí)至發(fā)酵結(jié)束,挑醅期以更快的增長速度持續(xù)增長至最高,這與該時(shí)期產(chǎn)酸菌的迅速增長有關(guān)；立醅期則在7對(duì)時(shí)后緩慢上升至最高,兩個(gè)時(shí)期在出缸時(shí)酸度相差最多為2.22。

圖1 立醅(LP)與挑醅(TP)期發(fā)酵酒醅樣品酸度變化Fig.1 Changes of acidity of fermented grains in LP and TP

2.2 立醅與挑醅期大茬發(fā)酵過程微生物生物量的動(dòng)態(tài)變化

兩個(gè)時(shí)期酒醅發(fā)酵過程中產(chǎn)酸菌生物量的變化如圖2所示。立醅大茬發(fā)酵期乳酸菌總數(shù)呈馬鞍形,存在二次發(fā)酵現(xiàn)象,發(fā)酵4對(duì)時(shí)至15對(duì)時(shí),環(huán)境產(chǎn)酸較弱,乳酸菌菌落數(shù)增減變化不大,而此后時(shí)期,耐酸乳桿菌是豐度最高優(yōu)勢(shì)菌[13-15],乳酸菌開始增長,推測(cè)延遲發(fā)酵期有助于酒醅酸度上升；挑醅大茬發(fā)酵期乳酸菌總數(shù)變化呈先增后減趨勢(shì),產(chǎn)酸菌生物量高于立醅期；大茬立醅發(fā)酵期入缸平板芽胞桿菌是優(yōu)勢(shì)菌,而大茬挑醅發(fā)酵期入缸平板先長乳酸菌3 d后才長芽胞桿菌,推測(cè)立醅期發(fā)酵材料中富集環(huán)境的乳酸菌較少或乳酸菌活力較弱,很難較快增長；挑醅期材料產(chǎn)酸高,發(fā)酵前期乳酸菌增長快,發(fā)酵后期,由于還原糖不足及環(huán)境酸度過高等特殊環(huán)境,乳酸菌生長受抑制而大幅下降至無。

圖2 立醅與挑醅期發(fā)酵過程中產(chǎn)酸菌的生物量變化Fig.2 Viable lactic acid bacteria counts of fermented grains in LP and TP

2.3 立醅與挑醅期發(fā)酵酒醅樣品及酒體SCFAs含量變化

標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量較好可以用于定量分析(R2>0.99)。分別對(duì)兩個(gè)時(shí)期的7種SCFAs含量變化做差異性對(duì)比,結(jié)果如圖3所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息和標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard reference materials and standard curve

由圖3-a所示,立醅期入缸乙酸含量顯著低于挑醅期,但在大茬發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到同一水平。兩個(gè)時(shí)期在0～7對(duì)時(shí)隨發(fā)酵進(jìn)行乙酸含量上升,7～15對(duì)時(shí)立醅期略有下降,挑醅期以更快的速度增長,而在15對(duì)時(shí)-出缸,立醅期乙酸迅速增長,挑醅期開始下降仍高于立醅期。立醅期較挑醅期發(fā)酵水平延滯,增加立醅期發(fā)酵對(duì)于乙酸水平的增加有正向作用。

由圖3-b所示,立醅期丙酸含量顯著低于挑醅期,起始含量相差12倍,為最大。產(chǎn)丙酸的菌群在立醅期最缺失,在環(huán)境中很難短期培養(yǎng)。丙酸菌在清香型白酒的中的研究極少。而丙酸菌對(duì)于酒體產(chǎn)香與增乙降乳都有一定的作用。

由圖3-c所示,立醅期入缸異丁酸含量略低于挑醅期,但在大茬發(fā)酵結(jié)束后相差不多。兩個(gè)時(shí)期在整個(gè)大茬發(fā)酵過程中異丁酸呈逐漸上升趨勢(shì),4～15對(duì)時(shí)增長緩慢,15對(duì)時(shí)至出缸發(fā)酵后期迅速增長至最高。

由圖3-d所示,立醅期入缸丁酸含量顯著低于挑醅期,在大茬發(fā)酵結(jié)束后相差最大。立醅整個(gè)發(fā)酵期呈遞增趨勢(shì),挑醅呈先降后升趨勢(shì),入缸后至4對(duì)時(shí)稍有下降,4～14對(duì)時(shí)兩個(gè)時(shí)期丁酸含量以同一水平保持不變,發(fā)酵后期,立醅期上升4倍至最高,挑醅期上升8倍增至最高。

由圖3-e所示,立醅期異戊酸含量顯著低于挑醅期,立醅期整個(gè)發(fā)酵過程變化不大,兩個(gè)時(shí)期均呈緩慢的先增后降再迅速增長趨勢(shì),立醅期7對(duì)時(shí)開始下降,15對(duì)時(shí)上升至出缸；挑醅期4對(duì)時(shí)緩慢下降,7對(duì)時(shí)至出缸一直上升至最高,立醅較挑醅期在該指標(biāo)上有延滯。

由圖3-f所示,立醅期戊酸含量顯著低于挑醅期,兩個(gè)時(shí)期發(fā)酵變化趨勢(shì)不同。挑醅期入缸與出缸時(shí)含量最高相差不多,4～15對(duì)時(shí)略微變化。立醅期在入缸至15對(duì)時(shí)基本保持不變,發(fā)酵后期開始上升,較挑醅期相差3.45倍。

a-乙酸；b-丙酸；c-異丁酸；d-丁酸；e-異戊酸；f-戊酸；g-己酸圖3 立醅與挑醅期發(fā)酵過程中各短鏈脂肪酸變化Fig.3 Comparison of SCFAs dynamics of fermented grains in LP and TP

如圖3-g所示,立醅期己酸含量顯著低于挑醅期,兩個(gè)時(shí)期發(fā)酵變化趨勢(shì)不同。但與戊酸的變化趨勢(shì)一致。

由圖4可知,整體來看,挑醅期的SCFAs含量均高于立醅各指標(biāo)含量,且乙酸、異丁酸及異戊酸在兩個(gè)時(shí)期隨發(fā)酵進(jìn)程呈遞增趨勢(shì),而己酸、戊酸及丙酸在挑醅發(fā)酵起始含量較高,隨發(fā)酵進(jìn)行呈先減后增趨勢(shì),在整個(gè)發(fā)酵過程中挑醅期高表達(dá),尤其是丙酸,兩時(shí)期發(fā)酵末期差異倍數(shù)最高。立醅期除乙酸、異丁酸外其他幾種酸在7對(duì)時(shí)開始增長直至最高。立醅期產(chǎn)酸最高水平只接近于挑醅期7對(duì)時(shí),顯然,熱季發(fā)酵環(huán)境對(duì)產(chǎn)酸水平有很大影響。

圖4 立醅與挑醅期發(fā)酵過程中各短鏈脂肪酸變化熱圖Fig.4 Heatmap of SCFAs of fermented grains in LP and TP

立醅期、挑醅期一車間的酒體乙酸含量均是最高,與該車間特殊的微生態(tài)環(huán)境下的產(chǎn)酸菌有關(guān)；除己酸外,熱季挑醅期的SCFAs含量均高于立醅期各指標(biāo)含量。熱季停排對(duì)立醅發(fā)酵產(chǎn)酸有直接影響。

立醅期4個(gè)車間除乙酸外其他SCFAs相差不多,其中立醅期7車間原酒丙酸含量最高,其他指標(biāo)均是最少含量；汾一車間除丙酸外其他SCFAs含量在立醅期均是最高；挑醅期除乙酸、戊酸外其他均是汾九車間的最高；汾十二車間的各SCFAs均是最低。

圖5 立醅與挑醅期酒體中各短鏈脂肪酸變化熱圖Fig.5 Heatmap of SCFAs of Baijiu in LP and TP

3 結(jié)論與討論

立醅與挑醅是清香型白酒新一輪發(fā)酵的始末兩個(gè)時(shí)期,基于此特殊性,在大生產(chǎn)中最易出現(xiàn)質(zhì)量不穩(wěn)定,優(yōu)質(zhì)率下降的問題。本文針對(duì)這一現(xiàn)象,對(duì)兩個(gè)時(shí)期發(fā)酵產(chǎn)酸情況進(jìn)行對(duì)比分析,研究證實(shí)了發(fā)酵過程SCFAs的變化的差異性,與以往認(rèn)知不同的是,無論在發(fā)酵過程還是原酒中,乙酸的差異倍數(shù)并不顯著,需要關(guān)注的是除乙酸外的其他SCFAs的差異造成的影響,同時(shí)應(yīng)關(guān)注這些SCFAs相應(yīng)的合成微生物及參與的代謝途徑,以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控微生物發(fā)酵及酒體質(zhì)量穩(wěn)定?，F(xiàn)已對(duì)濃香型白酒釀造體系來源的SCFAs合成微生物種類、代謝途徑及其與其品質(zhì)的關(guān)系的研究[16-19]。

結(jié)合兩時(shí)期的發(fā)酵情況來分析,挑醅期發(fā)酵環(huán)境最易產(chǎn)酸,發(fā)酵起始產(chǎn)酸菌已高度富集,酸度隨發(fā)酵持續(xù)上升,致使酵母菌增長受限,還原糖利用率下降,酒醅酸敗使發(fā)酵不完全,進(jìn)一步影響出酒率,而蒸餾截酒在保證酒精度的前提下,酒尾中的SCFAs乙酸、乳酸等只有少量接出；立醅期發(fā)酵產(chǎn)酸全周期最低,菌群中產(chǎn)酸菌比例下降,酸度上升速度較緩慢,使酵母菌對(duì)還原糖利用率相對(duì)較高,發(fā)酵較完全,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)科學(xué)在實(shí)際蒸餾截酒時(shí)較挑醅期可適當(dāng)拉長酒尾,將乙酸、乳酸等接入原酒,因此,兩時(shí)期的發(fā)酵材料酸指標(biāo)相差很大,酒體SCFAs差異倍數(shù)縮小,通過調(diào)整工藝范圍參數(shù)可保證了兩個(gè)時(shí)期酒體風(fēng)格一致[20]。