王超,劉小芳,徐慧,楊釗*

1(青島市食品藥品檢驗研究院,山東 青島,266071) 2(中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點實驗室,山東 青島,266071)

酒類產(chǎn)品品種繁多,口味獨特,在社交娛樂及養(yǎng)生保健方面都占有重要的位置。酒類產(chǎn)品中添加利尿劑能夠促進機體快速排尿,去除飲酒而帶入體內(nèi)的大量水分。利尿劑通過選擇性阻斷鈉-鉀-氯等共同轉(zhuǎn)運體來促進尿液中鈉和水的排泄[1-2]或保鉀以達到排鈉排尿的作用,部分利尿劑聯(lián)合使用可以起到更好的利尿效果[3]。但人體長期攝入利尿劑易引起低血鈉、低血鉀、低血鎂等電解質(zhì)紊亂及高尿酸血癥等代謝紊亂癥狀,同時存在痙攣、尿頻等其他不良反應(yīng)[1-4],嚴重影響身體健康,必須嚴格控制機體的攝入來源。

目前,保健食品及中成藥中非法添加化學藥物的檢測主要是先通過液相色譜法進行色譜分離初篩,采用保留時間和紫外吸收光譜初步定性,初篩為陽性的樣品經(jīng)液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法或液相色譜-離子阱/軌道阱進行確證[5-7]。液相色譜法的分離能力有限,復雜基質(zhì)的樣品中干擾峰較多,增加了分離的難度和色譜分析的時間；液相色譜質(zhì)譜法靈敏度較高,且各化合物之間在保留時間上不必完全分離,其中液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法和液相色譜-離子阱/軌道阱屬于高分辨檢測儀器,在未知化合物的碎片解析及已知化合物的定性確證方面應(yīng)用較多,定量能力有待改進[8-11]；液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法抗干擾能力較強,可針對每個化合物設(shè)定專有通道進行檢測,且精密度較好,適合多種已知的化合物同時進行定性、定量分析檢測[12]。

本文涉及的11種化合物中個別化合物因不同的功效在不同的基質(zhì)中被檢出的情況已有報道,所涉及的基質(zhì)包括尿液、保健食品和化妝品[13-16],所涉及的檢測技術(shù)包括液相色譜法初篩后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法[13]或液相色譜-離子阱/軌道阱進行定性確證[14-15]、通過液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法直接進行定性和定量分析[16],其中氣相色譜-質(zhì)譜法確證前需要進行衍生化處理,衍生過程繁瑣且衍生物不穩(wěn)定[13]。酒類產(chǎn)品中11種利尿化合物的定性定量檢測未見報道。綜上,本文建立酒類產(chǎn)品中非法添加利尿組分的快速分離液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(rapid resolution liquid chromatography-mass spectrometry,RRLC-MS/MS)方法,上機后可在13 min內(nèi)同時完成11種利尿化合物的定性及定量檢測,方法篩查效率高、靈敏度高、準確性強,為監(jiān)督酒類產(chǎn)品質(zhì)量和打擊酒類產(chǎn)品中非法添加利尿組分行為提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 prime-6470A液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,美國Agilent公司；Sartourious BT125D十萬分之一電子天平,德國賽多利斯公司；AS 20500B超聲波清洗器,天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

1.2 材料與試劑

對照品：氫氯噻嗪(批號 100309—201103，含量99.8%)、茶堿(批號100121—201805，含量99.9%)、米諾地爾(批號100238—201702，含量99.7%)、氨苯蝶啶(批號100429—201602，含量99.8%)、呋塞米(批號100544—201503，含量99.3%)、吲達帕胺(批號100257—201605，含量97.7%)、螺內(nèi)酯(批號100193—201704，含量99.9%)、非洛地平(批號 100717—201403，含量99.6%)，中國食品藥品檢定研究院；芐氟噻嗪(批號100007—200703，含量100%)、環(huán)戊噻嗪(批號100188—199701，含量100%)，中檢所；坎利酮(批號MS190929—20，含量98.06%)，Stanford Chemicals。

樣品：從山東省青島市的超市和便利店采購10批酒類產(chǎn)品,涉及啤酒、葡萄酒、果酒、黃酒4種類型,其中啤酒3批,葡萄酒3批,果酒2批,黃酒2批。

甲醇、乙腈,色譜純，德國默克；甲酸(色譜純),賽默飛世爾科技有限公司；水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取11種化合物對照品10 mg至10 mL量瓶中,加入甲醇4 mL,振搖溶解,螺內(nèi)酯、茶堿需超聲處理(功率100%,頻率40 kHz)5 min,并振搖溶解,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述對照品溶液各0.1 mL至10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述對照品溶液各1 mL至25 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品的上機參數(shù)優(yōu)化用溶液。

精密稱取11種化合物對照品各50 mg至同1個50 mL量瓶中,加入甲醇25 mL,超聲處理(功率100%,頻率40 kHz)5 min,并振搖使溶解,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合對照品溶液；精密量取上述混合對照品溶液0.1 mL至50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得2 μg/mL的混合對照品溶液；精密量取上述混合對照品溶液50、100、300、500、1 000 μL至10 mL量瓶中,用甲醇-水(體積比9∶1)稀釋至刻度,搖勻,作為線性方程用系列對照品溶液,質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.06、0.1、0.2 μg/mL。

1.3.1.2 樣品溶液的制備

精密稱取樣品約0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入甲醇5 mL,超聲處理(功率100%,頻率40 kHz)提取5 min,冷卻至室溫,用甲醇定容至刻度,搖勻；精密量取上述溶液0.1 mL至100 mL量瓶中,用甲醇-水(體積比9∶1)稀釋至刻度,搖勻,過0.22 μm的微孔濾膜即得樣品溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 Rapid Resolution HD色譜柱(3.0 mm×50 mm,1.8 μm)；流動相：以0.1%(體積分數(shù))的甲酸溶液為流動相A,以含0.1%(體積分數(shù))甲酸的甲醇為流動相B,梯度洗脫(0～3 min：95%A→60%A；3～8 min：60%A →20%A；8～10.5 min：20%A→ 20%A；10.5～10.7 min：20%A→ 95%A；10.7～16.0 min：95%A)；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

實驗采用電噴霧離子源(AJS ESI),各化合物分別在正離子或負離子模式下通過動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進行測定；干燥氣溫度為300 ℃；干燥氣流速為9 L/min；霧化氣壓力為37 psi；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為11 L/min；正離子模式時,毛細管電壓為3 600 V,噴嘴電壓為400 V；負離子模式時,毛細管電壓為 3 000 V,噴嘴電壓為400 V；質(zhì)譜的碰撞氣為高純氮氣。11種化合物22個通道優(yōu)化后的動態(tài)MRM方法中母離子、定性子離子、定量子離子、碎裂電壓及碰撞能量等參數(shù)見表1,11種化合物的提取離子色譜圖見圖1。

1-氫氯噻嗪;2-茶堿;3-米諾地爾;4-氨苯蝶啶;5-呋塞米;6-吲達帕胺;7-芐氟噻嗪;8-環(huán)戊噻嗪;9-螺內(nèi)酯;10-坎利酮;11-非洛地平圖1 11種化合物的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 11 compounds

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)和方法專屬性的考察

實驗選取啤酒、葡萄酒、果酒、黃酒4種類型的陰性樣品基質(zhì)進行等體積混合,得到混合基質(zhì)溶液。用甲醇-水(體積比9∶1)配制50 ng/mL的純?nèi)軇┗旌蠘藴嗜芤?待測；精密稱取混合基質(zhì)溶液0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入1.3.1.1中1 mg/mL的混合對照品溶液5 mL,按照1.3.1.2的方法制備得到50 ng/mL的混合基質(zhì)加標溶液,待測。將50 ng/mL的純?nèi)軇┗旌蠘藴嗜芤汉?0 ng/mL的混合基質(zhì)加標溶液上機測定,通過計算2種溶液中化合物的響應(yīng)值百分比來考察基質(zhì)效應(yīng)的影響[17-19]。

表1 11種化合物的母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量Table 1 Precursor ions,product ions,fragmentor and collision energy of 11 compounds

實驗選取啤酒、葡萄酒、果酒、黃酒4種類型的陰性樣品,分別按照1.3.1.2的制備方法得到空白基質(zhì)溶液,按1.3.2和1.3.3的方法進樣測定,考察方法的專屬性。

1.3.5 方法的線性、檢出限、定量限和回收率

將1.3.1.1中制備的線性方程用系列對照品溶液按照1.3.2和1.3.3項下的色譜條件和質(zhì)譜條件進行測定,以化合物的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,以定量離子對的峰面積為縱坐標繪制線性方程。以3倍信噪比計算各化合物的檢出限,以10倍信噪比計算各化合物的定量限。精密稱取1.3.4中混合基質(zhì)溶液0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入1.3.1.1中1 mg/mL的混合對照品溶液10 mL,按照1.3.1.2的方法制備得到100 ng/mL的混合基質(zhì)加標溶液,平行制備6份,按1.3.2和1.3.3的方法進樣測定,計算平均回收率和相對標準偏差。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用美國Agilent公司的QQQ Quantitative Analysis程序軟件和Microsoft Office Excel 2007軟件,繪圖采用Microsoft Office Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗選用1.3.1.1的對照品上機參數(shù)優(yōu)化用溶液上機,對11種化合物分別進行ESI+和ESI-條件下的一級全掃,根據(jù)一級全掃結(jié)果確認化合物的電離模式,并選定合適的母離子,通過設(shè)定不同的碎裂電壓,以母離子的響應(yīng)強度為觀察目標選定最優(yōu)碎裂電壓,在此碎裂電壓下進行目標母離子的二級全掃,選擇強度最大的2個碎片離子分別進行碰撞能量的優(yōu)化,在最優(yōu)碎裂電壓和最優(yōu)碰撞能量下響應(yīng)強度最大的定為定量子離子,響應(yīng)強度次之的定為定性子離子,綜合11種化合物的上述參數(shù)建立該11種化合物的MRM方法。為充分提高每種化合物的靈敏度,實驗在MRM方法參數(shù)的基礎(chǔ)上根據(jù)保留時間建立了11種化合物22個通道的動態(tài)MRM方法。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在前期的實驗基礎(chǔ)上,選取了0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈2種流動相體系對11種化合物的色譜行為和響應(yīng)強度進行考察。流動相為0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈條件下,砍利酮、螺內(nèi)酯響應(yīng)較弱,氨苯喋啶響應(yīng)較強；流動相為0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇條件下,氨苯喋啶響應(yīng)略有降低,但其他化合物響應(yīng)與前一種流動相體系相比無較大影響或有增強。綜合考慮化合物的出峰時間、分離情況和響應(yīng)強度,實驗選用0.1%甲酸溶液作為流動相A,含0.1%甲酸的甲醇作為流動相B進行測定?；谏鲜錾V條件,結(jié)合優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù),建立11種化合物22個通道的快速液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用方法。

2.3 溶劑的優(yōu)化

以0.1%的甲酸溶液為流動相A,以含0.1%甲酸的甲醇為流動相B,考察對照品和樣品上機前最后一步的稀釋溶劑,實驗選定甲醇-水(體積比1∶9)、甲醇-水(體積比5∶5)、甲醇-水(體積比9∶1)與甲醇共4種溶劑進行溶解并測定,結(jié)果見圖2,發(fā)現(xiàn)氨苯喋啶、氫氯噻嗪、非洛地平的響應(yīng)隨著甲醇濃度的升高而增強,純甲醇作為溶劑時響應(yīng)最強,略高于甲醇-水(體積比9∶1)作為溶劑時的響應(yīng)強度；其余化合物均在甲醇-水(體積比9∶1)作為溶劑時響應(yīng)最強。

1-氫氯噻嗪；2-茶堿；3-米諾地爾；4-氨苯蝶啶；5-呋塞米；6-吲達帕胺；7-芐氟噻嗪；8-環(huán)戊噻嗪；9-螺內(nèi)酯；10-坎利酮；11-非洛地平圖2 溶劑對11種化合物的影響Fig.2 Effect of solvent to 11 compounds

為充分提高化合物的靈敏度,綜合考慮,實驗選定甲醇-水(體積比9∶1)作為對照品和供試品上機前最后一步的稀釋溶劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)和方法專屬性

將1.3.4中50 ng/mL的純?nèi)軇┗旌蠘藴嗜芤汉?0 ng/mL的混合基質(zhì)加標溶液上機測定,計算2種溶液中化合物的響應(yīng)值百分比,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氨苯喋啶、米諾地爾等響應(yīng)值百分比大于1,呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng),環(huán)戊噻嗪、芐氟噻嗪、氫氯噻嗪響應(yīng)值百分比小于1,呈現(xiàn)基質(zhì)增強效應(yīng),吲噠帕胺、螺內(nèi)酯、砍立酮等基質(zhì)效應(yīng)影響不大。結(jié)果表明11種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在77.4%～112.8%,因為非法添加藥物的添加劑量一般需要添加到能夠發(fā)揮藥效的劑量,通常為毫克級別,不屬于痕量檢測,所以常見的4種類型的陰性樣品基質(zhì)對該11種化合物的基質(zhì)效應(yīng)影響在可接受范圍內(nèi)[20]。

按照1.3.4考察該方法的專屬性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種類型的22個通道中均未見有干擾11種目標化合物的色譜峰,方法的專屬性較好。

2.5 方法的線性、檢出限、定量限和回收率

按照1.3.5的方法得到的線性方程、檢出限和回收率結(jié)果見表2。11種化合物在本實驗的線性范圍內(nèi)均具有良好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0；以3倍信噪比計算的11種化合物的檢出限在0.8～133.9 ng/g,定量限在2.7～446.3 ng/g,靈敏度較高；6份加標樣品中11種化合物的平均回收率為88.3%～105.3%,平均相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.3%～2.2%,回收率較高。

表2 11種化合物的線性方程、檢出限和回收率Table 2 Liner equations,detection limits and recoveries of 11 compounds

2.6 樣品測定

將1.2中10批酒類市售產(chǎn)品按照1.3.1.2方法制備,按照1.3.2和1.3.3方法上機測定,通過比較供試品和對照品中11種化合物的定性離子對和定量離子對的保留時間、定性離子對與定量離子對的離子比率進行定性,以定量離子對的峰面積進行外標法定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中均未檢出11種目標成分,這可能與該10批樣品均為大型超市購買的正規(guī)市售產(chǎn)品有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究首次建立了一種快速篩查酒類產(chǎn)品中非法添加11種利尿組分的RRLC-MS/MS方法,可在13 min內(nèi)同時完成該11種化合物的定性篩查和定量檢測,方法操作簡便、篩查效率高,具有較好的方法專屬性和較高的靈敏度,重復性好,對酒類產(chǎn)品的安全監(jiān)督及風險性篩查工作具有重要意義。