樊雙喜,劉一諾,吉鑫,常迪,馮翠萍,武竹英,鐘其頂,3*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015) 2(全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,北京,100015) 3(國家食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心,北京,100015)

乳糖是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖縮合而成的一種雙糖,其甜度約為蔗糖的17%[1]。乳糖可以促進(jìn)新陳代謝,有助于腸道內(nèi)的乳酸菌繁殖增長以及腸道內(nèi)礦物質(zhì)的吸收,抑制腸內(nèi)有害細(xì)菌的繁殖增長,防止齲齒[2]。近些年來,隨著我國乳業(yè)的快速發(fā)展,乳制品質(zhì)量也暴露出各種隱患,其中牛乳中摻假尤為嚴(yán)重[3],快速、準(zhǔn)確地測定乳制品所包含的成分對保證乳制品品質(zhì)、防止摻假以及保障人民身體健康具有重要的意義。由于乳糖在牛乳中含量比較穩(wěn)定,通常為4.5%～5.0%[4],摻假物的添加容易使乳糖的含量發(fā)生較為明顯的變化,因此,原料乳中是否存在摻假行為可以通過測定牛乳中乳糖含量進(jìn)行初步判斷[5]。此外,根據(jù)低乳糖牛奶工藝研究發(fā)現(xiàn),我國成人腸道缺乏乳糖酶人群占比大于90%,他們無法將乳制品中的乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖和葡萄糖,飲用正常乳糖含量乳制品后,會(huì)引起胃脹氣、痙攣、消化不良和腹痛腹瀉等一系列不適癥狀(即乳糖不耐癥)[6]。為滿足眾多乳糖不耐癥消費(fèi)者的需求,低乳糖乳制品應(yīng)運(yùn)而生并深受廣大消費(fèi)者和食品市場歡迎,低乳糖產(chǎn)品未來具有十足的市場發(fā)展空間。國標(biāo)GB 28050—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》明確規(guī)定：低乳糖,乳糖含量≤2 g/100 g(mL)；無乳糖,乳糖含量≤0.5 g/100 g(mL),但是目前市場上存在虛假聲稱的低乳糖和無乳糖奶制品,損害了消費(fèi)者的合法權(quán)益,嚴(yán)重阻礙了中國乳業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。

目前乳品中乳糖含量的檢測主要采用國標(biāo)GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》,即萊因—埃農(nóng)氏法(滴定法)和高效液相色譜法,另外還有分光光度法[7]、酶電極法[8]、酶-比色法[9]以及近紅外光譜法[10]等。萊茵-埃農(nóng)氏法(滴定法)所使用的試劑具有一定腐蝕性且對操作人員的操作技能要求較高,耗時(shí)長、操作繁瑣,滴定終點(diǎn)肉眼不易判斷,易產(chǎn)生誤差,結(jié)果不太準(zhǔn)確。直接滴定法應(yīng)用于復(fù)雜食品基質(zhì)中存在多種還原糖的情況,測定結(jié)果在一定程度上會(huì)受到干擾,測定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對于檢測的干擾,但其顯著缺點(diǎn)是耗時(shí)長、分析成本較高、示差折光檢測器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性不足,尤其對于食品復(fù)雜基質(zhì)中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高,但對檢測條件的要求比較嚴(yán)格,樣品需在堿性條件下起顯色反應(yīng),操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其他還原糖的干擾。酶-比色法靈敏度較高,但顯著缺點(diǎn)是測定時(shí)間長,時(shí)效性難以保證,不易推廣[2]。近紅外光譜法需要大量樣本建立預(yù)測模型,建立模型過程比較復(fù)雜,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且操作人員需要具備較強(qiáng)的數(shù)據(jù)分析建模能力[11]；此外,由于水分子對紅外具有較強(qiáng)的吸收,會(huì)在一定程度上干擾液體樣品的檢測[2],測定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。故亟需開發(fā)一種能夠?qū)εＤ讨腥樘呛窟M(jìn)行快速、準(zhǔn)確且高效的定量檢測方法。

基于上述問題,本研究采用核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)波譜儀,基于脈沖寬度(pulse length based concentration determination,PULCON)[12-14]外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)[15-16]定量法,建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的牛奶中乳糖含量定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Amicon Ultra-15超濾管,Merck,Ireland；3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉[sodium-3-(trimethylsilyl) propionate-2,2,3,3-d4,TSP,98%],CIL；乳糖標(biāo)準(zhǔn)品(D-lactose,≥99.5%),Sigma；重水(D2O,99.9%),Sigma-Aldrich公司；檸檬酸(99%),Vetec；乙酸(≥99.5%),天津市大茂化學(xué)試劑廠；煙酰胺(≥99%),CNW Technologies；不同品牌牛奶樣品購買于電商平臺(tái)和北京市某大型超市。

Bruker Avance III HD 400M波譜儀、Bruker SampleJet 5 mm高通量核磁管、Bruker pH自動(dòng)調(diào)節(jié)裝置BTpH,Bruker Biospin,Rheinstetten,德國；Bruker 582位自動(dòng)進(jìn)樣器,SampleJet；Vortex-5渦旋混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；AB204-N天平,METTLER TOLEDO,瑞士。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)及TSP溶液的配制

乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用天平精確稱取0.512 g乳糖標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶,用含5%乙酸的水溶液定容,搖勻后得到51.2 g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用移液管準(zhǔn)確量取5.0 mL質(zhì)量濃度51.2 g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶,用含5%乙酸的水溶液定容,搖勻后得到25.6 g/L的乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用相同的方法,依次得到12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用5.0 mL含5%乙酸的水溶液作為空白對照組。

外標(biāo)溶液：用天平精確稱取0.2 g檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶,用蒸餾水定容,搖勻后得到2.0 g/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：用天平精確稱取0.5 g煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶,用重水定容,搖勻后得到質(zhì)量濃度10.0 g/L煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

TSP溶液：用天平精確稱取0.5 g TSP標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶,用重水定容,搖勻后得到10.0 g/L TSP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品制備

取20.0 mL牛奶樣品,加入1.0 mL 乙酸,8 000 r/min離心5 min,棄去脂肪和蛋白相,取上清液5.0 mL加入到Amicon Ultra-15超濾管,離心5 min。然后從超濾離心管底部取1.0 mL清澈的水相于樣品管中,加入100 μL TSP溶液和100 μL煙酰胺溶液,采用渦旋混合器振蕩混勻。取0.6 mL混合液于NMR管待測。

1.2.31H NMR測定參數(shù)

采用PA BBI 400S1 H-BB-D-05 Z探頭,NMR的共振頻率為400.13 MHz,儀器檢測溫度為300 K,Bruker Top Spin 2.1軟件采集1H NMR圖譜數(shù)據(jù),檢測信號(hào)時(shí)間3.984 6 s,延遲時(shí)間4.0 s,每次自由感應(yīng)衰減掃描次數(shù)為16,空掃描次數(shù)為4,譜寬15.1 ppm,采樣點(diǎn)數(shù)為65 536(64K),譜線加寬因子為0.3 Hz。以TSP(δ= 0 ppm)作為化學(xué)位移的零點(diǎn)。采用Bruker標(biāo)準(zhǔn)的脈沖序列(noesygppr1 d)用于水(δ= 4.8 ppm)特征峰信號(hào)抑制。每批次樣品檢測前,等待5 min穩(wěn)定檢測溫度。

1.2.41H NMR譜圖預(yù)處理

采用MestReNova 12.0軟件(Mestrelab Research S.L.,MestReNova(Mnova)NMR,USA)對1H NMR圖譜進(jìn)行傅里葉變換,基線矯正、相位調(diào)整和化學(xué)位移的定標(biāo)。

1.2.5 定量分析

采用MestReNova軟件qNMR定量模塊,進(jìn)行內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量分析[17]。

1.2.6 精密度分析

隨機(jī)選取一份牛奶樣品,采用1H NMR檢測方法,同一天內(nèi)重復(fù)測定5次,分析該方法的日內(nèi)精密度；重復(fù)測定5 d,測定結(jié)果取每日測定量的平均值,進(jìn)行方法的日間精密度分析。

1.2.7 加標(biāo)回收率分析

在同一份牛奶樣品中分別加入4份不同濃度水平的乳糖標(biāo)品溶液,每個(gè)濃度水平平行重復(fù)5次,采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,定量結(jié)果取5次重復(fù)測定的平均值,分別計(jì)算1H NMR方法的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8 準(zhǔn)確性分析

將1H NMR與國標(biāo)GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》高效液相色譜法所得牛奶樣品中乳糖的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)一步分析和驗(yàn)證1H NMR定量方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖1H NMR譜中特征峰確認(rèn)以及定量峰的選擇

乳糖(D-lactose)是一種雙糖,由一分子β-D-半乳糖和一分子α-D-葡萄糖在β-1,4-位形成糖苷鍵相連,乳糖在D2O中存在α和β兩種構(gòu)型[18-19],化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。以TSP為內(nèi)標(biāo),測定乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR譜,如圖2所示,并對乳糖1H NMR譜特征信號(hào)峰進(jìn)行歸屬(原子序號(hào)1′,δH = 4.44 ppm,1H,d,J=7.8 Hz),與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[20],化學(xué)位移分布在δH 3.4～4.0 ppm的質(zhì)子信號(hào)峰多發(fā)生重疊現(xiàn)象,難以歸屬,因此,δH 3.4～4.0 ppm質(zhì)子信號(hào)峰不能用做定量特征峰分析。根據(jù)乳糖結(jié)構(gòu)(圖1),乳糖中葡萄糖基的端基質(zhì)子存在α和β兩種構(gòu)型,且在D2O中可相互轉(zhuǎn)化,不宜用于定量[18]；α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰(δH 4.44 ppm)與樣品中其他成分信號(hào)峰無重疊,僅裂分為雙重峰,峰形尖銳,適合定量。

a-β乳糖;b-α乳糖圖1 乳糖在D2O中構(gòu)型Fig.1 Configurations of lactose in D2O

但由于α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰(δH 4.44 ppm)與基質(zhì)水特征信號(hào)峰(δH 4.78 ppm)距離比較近,考慮到水峰壓制可能對準(zhǔn)確定量結(jié)果產(chǎn)生影響,本研究采用校正因子(cortect factor,CF)來校正水峰信號(hào)的壓制對定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響,與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[17,21]；此外,MONAKHOVA等[20]也是選取α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰(δH 4.44 ppm)作為乳糖定量特征峰,基于核磁共振技術(shù)實(shí)現(xiàn)了普通牛奶和脫乳制品中乳糖含量的準(zhǔn)確定量,因此,綜合考慮后選取α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰(δH 4.44 ppm)作為牛奶樣品中乳糖含量定量特征峰。

圖2 以TSP為內(nèi)標(biāo)的乳糖1H NMR譜圖Fig.2 The1H NMR spectra of lactose with TSP as internal standard

2.2 內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)物的選擇

外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)參考物的選擇應(yīng)當(dāng)滿足一般核磁定量檢測對外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的要求,其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)簡單,在1H NMR圖譜中具有獨(dú)特的化學(xué)位移,易辨認(rèn)識(shí)別,內(nèi)標(biāo)物不能與待測樣品產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng),易溶于待測樣品,信號(hào)與待測樣品信號(hào)無重疊。檸檬酸和煙酰胺完全滿足以上條件,檸檬酸1H NMR圖譜特征信號(hào)峰在δH 2.81和δH 2.96 ppm處2組特征信號(hào)雙峰完全對稱,如圖3所示,易于辨認(rèn),積分準(zhǔn)確。煙酰胺能溶于牛奶樣品,煙酰胺1H NMR圖譜在δH 9.17 ppm特征信號(hào)峰不與牛奶基質(zhì)中各種其他化合物信號(hào)峰發(fā)生重疊,因此,選用檸檬酸和煙酰胺作為1H NMR定量方法的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)參考物質(zhì)。

圖3 檸檬酸1H NMR譜圖Fig.3 The1H NMR spectra of citric acid

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度分析

選取一份牛奶樣品,采用1H NMR方法,同一天內(nèi)重復(fù)測定5次,分析該方法的日內(nèi)精密度；重復(fù)測定5 d,測定結(jié)果取每日測定量的平均值,進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的日間精密度分析,結(jié)果如表1、表2所示。由表1、表2可知,以檸檬酸作為PULCON的外標(biāo)參考物,方法的日內(nèi)和日間精密度RSD分別為0.58%和0.56%；以煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)參考物,方法的日內(nèi)和日間RSD分別為0.42%和0.94%。內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)方法的日內(nèi)和日間RSD均小于1%；采用T檢驗(yàn)法分析日內(nèi)與日間同一牛奶樣品中乳糖測定結(jié)果的差異性,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明日內(nèi)與日間檢測結(jié)果無顯著性差異(P>0.05),以上表明1H NMR牛奶乳糖檢測方法滿足精密度的要求。

表1 外標(biāo)法日間與日內(nèi)精密度(n=5)Table 1 Precision of intra-day and inter-day for external standard method(n=5)

表2 內(nèi)標(biāo)法日間與日內(nèi)精密度(n=5)Table 2 Precision of intra-day and inter-day for internal standard method(n=5)

2.3.2 加標(biāo)回收率分析

2.3.2.1 外標(biāo)法

在同一份牛奶樣品中分別加入7.5、25.0、50.0 和100.0 g/L 4份不同濃度水平的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行重復(fù)5次,采用PULCON檸檬酸外標(biāo)法進(jìn)行定量分析,定量結(jié)果取5次重復(fù)測定的平均值,如表3所示。

表3 外標(biāo)法回收率(n=5)Table 3 Recovery of external standard method(n=5)

由表3可知,在4個(gè)不同加標(biāo)質(zhì)量濃度水平下,PULCON檸檬酸外標(biāo)法的回收率在91.0%～97.5%,其平均回收率為95.2%,且回收率的RSD為1.1%～2.9%,結(jié)果表明以檸檬酸作為PULCON外標(biāo)參考物,1H NMR方法精確度良好,能夠滿足牛奶中乳糖含量的準(zhǔn)確定量測定。

2.3.2.2 內(nèi)標(biāo)法

在同一份牛奶樣品中分別加入7.5、25.0、50.0和100.0 g/L 4份不同濃度水平的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行重復(fù)5次,采用煙酰胺內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,定量結(jié)果取5次重復(fù)測定的平均值,如表4所示。由表4可知,在4個(gè)不同加標(biāo)質(zhì)量濃度水平下,煙酰胺內(nèi)標(biāo)法的回收率為95.4%～99.5%,其平均回收率為97.6%,回收率的RSD為1.0%～1.7%,結(jié)果表明以煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)參考物,1H NMR方法精確度良好,能夠滿足牛奶中乳糖含量的準(zhǔn)確定量測定。

2.3.3 方法精確性分析

應(yīng)用上述已經(jīng)建立的1H NMR內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量方法和國標(biāo)GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》高效液相色譜法分別對市售15個(gè)不同種類牛奶樣品基質(zhì)中的乳糖含量進(jìn)行檢測,每個(gè)樣品平行前處理2次,每個(gè)樣品重復(fù)測定2次,定量測定結(jié)果取平均值,結(jié)果如表5所示,進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析1H NMR法與國標(biāo)法檢測結(jié)果的差異。由表5可知,當(dāng)牛奶中乳糖含量為0.80 g/L,國標(biāo)GB 5413.5—2010高效液相色譜法未檢出,1H NMR法有檢出,產(chǎn)生差異的原因主要是由于國標(biāo)GB 5413.5—2010高效液相色譜法[21]樣品前處理規(guī)定液態(tài)試樣稱取2.5 g于50 mL容量瓶中,加入15 mL 50～60 ℃水溶解,用乙腈定容至刻度,靜置后過濾。然后取5.0 mL過濾液于10 mL容量瓶中,用乙腈定容,至此樣品已經(jīng)稀釋了約40倍,且引入了乙腈有毒試劑；然而1H NMR法樣品前處理基本不稀釋,因此1H NMR法比國標(biāo)GB 5413.5—2010高效液相色譜法檢測靈敏度更高。以國標(biāo)高效液相色譜法測定結(jié)果為橫坐標(biāo),分別以1H NMR檸檬酸外標(biāo)和煙酰胺內(nèi)標(biāo)法的定量結(jié)果為縱坐標(biāo)做線性回歸,其線性回歸系數(shù)R2分別為0.96和1.01,表明1H NMR與國標(biāo)GB 5413.5—2010高效液相色譜法測定結(jié)果誤差在±5%以內(nèi),滿足方法的可行性驗(yàn)證要求,研究結(jié)果表明1H NMR定量法可以廣泛用于市售不同種類牛奶中乳糖含量的準(zhǔn)確測定。

表5 核磁共振波譜法與高效液相色譜法牛奶中乳糖測定結(jié)果 單位：g/L

3 結(jié)論

本研究建立了1種1H NMR技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確定量檢測牛奶中乳糖含量。該方法的檢出限為0.05 g/L(S/N=3),定量限為0.2 g/L(S/N=10)；在質(zhì)量濃度0.05～25.60 g/L內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.99)；煙酰胺內(nèi)標(biāo)法平均加標(biāo)回收率為97.6%,日內(nèi)與日間RSD分別為0.42%和0.94%；檸檬酸外標(biāo)法平均加標(biāo)回收率為95.2%,日內(nèi)與日間RSD分別為0.58%和0.56%；1H NMR測定方法重現(xiàn)性好；1H NMR定量法和GB 5413.5—2010高效液相色譜法測定結(jié)果誤差在±5%以內(nèi),測定結(jié)果準(zhǔn)確。1H NMR定量法相比于GB 5413.5—2010萊因―埃農(nóng)氏法,樣品前處理操作簡便,省時(shí)省力,無需使用腐蝕性試劑,大批量樣品檢測成本較低。相比于GB 5413.5—2010高效液相色譜法,樣品無需稀釋,不引入乙腈等有毒試劑,檢測靈敏度高,能夠滿足對于牛奶中乳糖含量的檢測要求,可廣泛應(yīng)用于牛奶制品質(zhì)量控制和摻假鑒別。