宣 磊，王芝權(quán)，殷云龍，華建峰

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇省落羽杉屬樹木種質(zhì)創(chuàng)新與繁育工程研究中心，江蘇南京 210014)

中山杉（Taxodiumhybrid‘Zhongshanshan’）是江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所從落羽杉屬樹木雜交組合中選育出的，是具有一定超親性狀的優(yōu)良無(wú)性系總稱。中山杉具有生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)、景觀性好、成材率高等特點(diǎn)，已在我國(guó)沿海防護(hù)林建設(shè)、公路及城鄉(xiāng)綠化、農(nóng)田林網(wǎng)和灘涂造林等方面得到廣泛應(yīng)用[1]。目前，中山杉無(wú)性系主要通過(guò)嫩枝扦插的方法進(jìn)行繁殖，近些年林業(yè)工作者一直致力于通過(guò)中山杉扦插技術(shù)改良來(lái)提高中山杉的生根率，研究表明：泥炭土、珍珠巖及沙壤土組成的混合基質(zhì)有利于大多數(shù)中山杉無(wú)性系生根[2]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度對(duì)中山杉扦插生根率影響顯著，2000mg·L?1IAA和2000mg·L?1NAA 混合液處理的中山杉無(wú)性系插條，生根率和生根數(shù)量都顯著提升。然而，在中山杉長(zhǎng)期選育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同無(wú)性系間生根能力差異顯著，即使優(yōu)化扦插技術(shù)，中山杉302 的平均生根率（57.50%）仍顯著低于中山杉118（83.93%）和406（87.14%）[3-4]，且隨著無(wú)性系生理年齡的增長(zhǎng)，早期選育出的無(wú)性系生根力出現(xiàn)衰退現(xiàn)象[1]，中山杉的生根機(jī)理亟需深入研究。

SHR（SHORT-ROOT）是植物GRAS 家族中與根系發(fā)生及形態(tài)建成密切相關(guān)的一個(gè)分支，對(duì)根尖干細(xì)胞微環(huán)境的特化和維持起著關(guān)鍵作用，它調(diào)控根皮層、內(nèi)皮層初始細(xì)胞及初始細(xì)胞子細(xì)胞的垂周和平周不均等分裂，影響植物根的輻射式生長(zhǎng)模式[5-7]。擬南芥shr突變體植株根尖分生組織的基本組織子細(xì)胞不能發(fā)生不對(duì)稱平周分裂，僅產(chǎn)生一層類似皮層的細(xì)胞[8]，shr突變體植株表現(xiàn)出主根生長(zhǎng)減弱，側(cè)根數(shù)量減少，植株矮小，子葉顏色深暗等一系列表型。過(guò)量表達(dá)SHR基因，根尖形態(tài)變化顯著，基本組織發(fā)生大量的平周分裂，產(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞層[9]。同時(shí)，SHR基因是一個(gè)功能進(jìn)化比較保守的基因，目前已在玉米（Zea maysLinn.）[10]、水稻（Oryza sativaLinn.）[11]、毛果楊（Populus trichocarpaTorr.&Gray.）[12]、輻射松（Pinus radiataD.Don）[13]等植物中發(fā)現(xiàn)的SHR 家族成員均和根的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)。研究表明：SHR 轉(zhuǎn)錄功能的行使，通常需要依靠其下游另一個(gè)GRAS家族成員SCR(SCARECROW)[14]。SCR 與SHR 形成SCR/SHR 復(fù)合體共同激活下游基因表達(dá)，SCR/SHR 復(fù)合體直接作用于CYCD6.1（Dtype cyclin 6.1）蛋白，CYCD6.1 是細(xì)胞發(fā)生平周分裂的標(biāo)志性蛋白，保證根尖細(xì)胞會(huì)在早期和晚期分別自發(fā)地進(jìn)行2 次平周分裂，產(chǎn)生完整的基本組織[15-17]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于不同植物SHR基因的挖掘以及SHR對(duì)根部細(xì)胞分裂調(diào)控機(jī)制的解析一直處于探索之中，本研究在前期已獲得2個(gè)中山杉SHR基因（ThSHR1,ThSHR2）的基礎(chǔ)上[18]，新篩選到1個(gè)在中山杉406 不定根生長(zhǎng)期高表達(dá)的基因ThSHR3，而ThSHR3的生物學(xué)功能尚不清楚，擬通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，探索其在中山杉不定根發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式，對(duì)ThSHR3 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位以及互作研究，推測(cè)其可能存在的信號(hào)通路。以期為中山杉以及落羽杉屬植物不定根發(fā)育的分子機(jī)理研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

“中山杉406”的嫩枝扦插試驗(yàn)于2019年7月中旬開展于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所中山杉苗圃內(nèi)。插穗長(zhǎng)度約10～15 cm，扦插基質(zhì)為珍珠巖和泥炭土，體積比例為1:1，光周期為14 h 的光照周期和10 h 的暗周期。根據(jù)中山杉406 插穗基部明顯的形態(tài)學(xué)改變，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣：0 d 皮層休眠期（S0），21 d 愈傷組織形成期（S1），35 d初生根形成期（S2）和56 d 根系生長(zhǎng)期（S3）[18]。其中，皮層休眠期和愈傷組織形成期的取樣部位為插穗基部皮層組織（0.3 cm 左右），初生根形成期和根系生長(zhǎng)期的取樣部位為根系。

RNeasy Plant Mini Kit 及Plant Genomic DNA Kit 購(gòu)自QIAGEN 公司；PrineScript @ RTase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、3′-Full RACE 和5′-FullRACE 試劑盒、LAtaq 酶、rtaq 酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；載體構(gòu)建使用的GATEWAY 技術(shù)及相關(guān)試劑均來(lái)自Invitrogen公司。

1.2 基因克隆

使用RNeasy Plant Mini Kit 試劑盒提取中山杉406 根總RNA，確保RNA 濃度為1 ng·μL?1，并通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。使用PrineScript @ RTase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成中山杉406 根cDNA，根據(jù)前期不定根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到605 bp 的目的基因ThSHR3的片段（CL8931.Contig2），通過(guò)PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證目的基因序列，PCR 擴(kuò)增體系如下：cDNA 模板1.0 μL，TaKaRa LA Taq (5 U·μL?1)0.5 μL，10×LA PCR Buffer (Mg2+Free) 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L?1)5.0 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol·L?1)8.0 μL，正向引物(10 μmol·L?1) 2.0 μL，反向引物(10 μmol·L?1) 2.0 μL，加超純水補(bǔ)至50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。進(jìn)一步參照TaKaRa 公司3′和5′-Full RACE 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行巢氏PCR 擴(kuò)增，完成ThSHR3基因全長(zhǎng)克隆，其中，涉及到的引物參考(表1)。將擴(kuò)增片段序列進(jìn)行序列比對(duì)、拼接，最終獲得了ThSHR3基因的全長(zhǎng)cDNA 序列。利用BioXM 軟件預(yù)測(cè)ThSHR3基因的開放閱讀框（ORF），進(jìn)一步通過(guò)PCR 驗(yàn)證。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 生物信息學(xué)分析

利用美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）在線BLAST 軟件比對(duì)分析ThSHR3的DNA 和蛋白質(zhì)序列。使用在線程序Expasy Protparam 計(jì)算蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)（pI）、分子量（MW）和氨基酸組成。通過(guò)PROSITE 以及GORIV 二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)程序分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用ClustalX2軟件將ThSHR3 的蛋白序列與其他植物已公布的SHR 蛋白序列進(jìn)行序列多重比對(duì)。利用NLStradamus程序預(yù)測(cè)ThSHR3 蛋白是否具有核定位信號(hào)。通過(guò)MEGA 7.0 軟件，選用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢測(cè)1 000 次。

1.4 實(shí)時(shí)定量及半定量PCR

以中山杉406 不定根發(fā)育的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)S0～S3為材料，根據(jù)已驗(yàn)證的cDNA 序列設(shè)計(jì)定量引物(表1)，以中山杉的APRT基因?yàn)閮?nèi)參基因[19]，采用半定量PCR 和熒光定量PCR 分別對(duì)ThSHR3進(jìn)行表達(dá)分析檢測(cè)。半定量PCR 反應(yīng)體系及程序參照rtaq 酶說(shuō)明書（https://www.takarabiomed.com.cn/）。選擇Analitik Jena qTOWER2.2 PCR 系統(tǒng)（Biometra，德國(guó)）進(jìn)行熒光定量RT-PCR（qPCR）。反應(yīng)程序設(shè)定為：50℃ 2 min；95℃ 10 min；40個(gè)循環(huán)：95℃ 15 s，60℃ 1 min；通過(guò)從60℃到95℃加熱擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得熔解曲線。反應(yīng)體系共20 μL，其中包括2μL稀釋后的cDNA，10 μL FastStart Universal SYBR Green Master（Rox，德國(guó)），10 pmol正向引物，10 pmol 反向引物以及滅菌去離子水，每個(gè)樣品設(shè)3 次技術(shù)重復(fù)，采用2?ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量的分析[20]。

1.5 載體構(gòu)建和原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)

表達(dá)的載體構(gòu)建利用Gateway Technology（Invitrogen，美國(guó)）技術(shù)，先將不包含終止密碼子的ThSHR3ORF 序列連接到入門載體pCR8/GW/TOPO 上，再使用LR 酶將入門載體連接到包含綠色熒光蛋白(GFP) 標(biāo)簽的目的載體p2GWF7 上。同理，使用相同的方法構(gòu)建ThSHR3 及ThSCR 的蛋白互作載體，目的載體為含有黃色熒光蛋白(YFP)標(biāo)簽的pUC-SPYNE、pUC-SPYCE。最終重組表達(dá)載體有：35S::ThSHR3-GFP、ThSHR3-YFPN、ThSHR3-YFPC、ThSCR-YFPN、ThSCR-YFPC。利用PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將測(cè)序正確的融合表達(dá)載體導(dǎo)入楊樹葉肉原生質(zhì)體中[21]。利用BX51 熒光顯微鏡（Olympus，日本）觀測(cè)樣品中熒光表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ThSHR3 基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)中山杉不定根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組及蛋白組數(shù)據(jù)，利用RACE 巢式PCR 擴(kuò)增，拼接得到ThSHR3基因的全長(zhǎng)序列。結(jié)果表明：ThSHR3基因的cDNA 全長(zhǎng)為2 019 bp，包含1個(gè)1 446 bp 的開放閱讀框（ORF），5′端非編碼翻譯區(qū)（UTR）長(zhǎng)度為354 bp，3′端非編碼翻譯區(qū)（UTR）長(zhǎng)度為219 bp。ThSHR3基因編碼482個(gè)氨基酸殘基。ExpasyProtparma 預(yù)測(cè)ThSHR3 分子量和等電點(diǎn)分別為66.082 和5.17。GOR IV 的分析結(jié)果顯示：ThSHR3 含有30.03%α 螺旋（Hh），15.77% 延伸鏈（Ee），54.19% 的無(wú)規(guī)則卷曲（Cc），不含有beta 轉(zhuǎn)角（Tt）。NLStradamus 程序預(yù)測(cè)ThSHR3 蛋白主要定位在細(xì)胞核上。Prosite 分析表明：ThSHR3蛋白具有保守的GRAS 結(jié)構(gòu)域。

2.2 ThSHR3 基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將ThSHR3 的蛋白質(zhì)序列與TAIR 中的擬南芥AtSHR(At4g37650.1) 蛋白序列和楊樹PeSHR1、PeSHR2、PeSHR3 蛋白序列[22]，中山杉ThSHR1（MF045148）、ThSHR2（MF045149）蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果表明：ThSHR 蛋白的N 端不保守，而C 端相對(duì)比較保守，和其他物種的SHR 蛋白一樣，ThSHR 蛋白包括GRAS 家族成員特有的LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE 和SAW基礎(chǔ)序列（圖1）。

將ThSHR3 的氨基酸序列與其他物種中已公布的45個(gè)較典型的GRAS 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明：GRAS 蛋白家族可劃分為具有不同的特征的SHR、DELLA、PATl、SCL9、SCR、LAS/SCL18、SCL4/7、HAM 的8個(gè)分支[9]（圖2）。ThSHR3 被劃分到SHR 分支，和其他物種的SHR 蛋白聚為一類，ThSHR3 和中山杉ThSHR1 親緣關(guān)系最近，同源性均為81%，和松科植物PmSHR（QCU71495.1）及輻射松PrSHR（ABW20412.1）的親緣關(guān)系也較近（圖2）。

2.3 ThSHR3 基因表達(dá)分析

本研究利用半定量PCR 和熒光定量PCR 方法，檢測(cè)ThSHR3基因在中山杉406 不定根皮層休眠期、愈傷組織形成期、初生根形成期和根系生長(zhǎng)期4個(gè)時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，內(nèi)參基因均為APRT基因。結(jié)果表明：ThSHR3基因在中山杉不定根4個(gè)不同發(fā)育階段均有表達(dá)。ThSHR3表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上升的表達(dá)模式，在根系生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，在皮層休眠期表達(dá)量最低，最高表達(dá)量是最低表達(dá)量的28.4 倍，且半定量PCR 和熒光定量PCR結(jié)果基本一致（圖3）。

2.4 ThSHR3 蛋白的亞細(xì)胞定位

本研究以綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，在前期已經(jīng)成熟的楊樹葉肉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的基礎(chǔ)上[21]，將中山杉重組融合表達(dá)載體導(dǎo)入楊樹葉肉原生質(zhì)體中。經(jīng)過(guò)18 h，23℃暗培養(yǎng)，觀察可得GFP 標(biāo)簽在488 nm 藍(lán)光激發(fā)下產(chǎn)生了509 nm 的綠色熒光，陽(yáng)性對(duì)照35S::GFP 在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等區(qū)域中都產(chǎn)生了明顯的綠色熒光信號(hào)，35S::ThSHR3-GFP 融合蛋白僅在細(xì)胞核區(qū)域產(chǎn)生綠色熒光，表明中山杉ThSHR3基因所編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核，這和前期在線程序預(yù)測(cè)結(jié)果一致，也符合其作為轉(zhuǎn)錄因子的特性（圖4）。

圖4 ThSHR3 在楊樹葉肉原生質(zhì)體內(nèi)的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular-localization of ThSHR3 in Populus mesophyll protoplasts

2.5 ThSHR3 與ThSCR 的蛋白互作

雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）是目前用于檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)互作的一項(xiàng)成熟技術(shù)，本研究利用BiFC 技術(shù)檢測(cè)中山杉的ThSHR3 與ThSCR 蛋白的互作情況，前期已經(jīng)證明ThSHR3 及ThSCR 亞細(xì)胞定位結(jié)果均定位在細(xì)胞核[23]。3 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ThSHR3-YFPN與ThSCR-YFPC、ThSHR3-YFPC與ThSCR-YFPN這2個(gè)組合的YFP 熒光蛋白重新恢復(fù)活性，在細(xì)胞核處觀察到清晰的熒光信號(hào)，2 組對(duì)照組合均無(wú)熒光信號(hào)產(chǎn)生（圖5），表明ThSHR3 與ThSCR 在細(xì)胞核發(fā)生了互作。

圖5 ThSHR3 和ThSCR 蛋白互作Fig.5 ThSHR3 and ThSCR interaction by BiFC

3 討論

根系是植物長(zhǎng)期適應(yīng)陸地生境而形成的重要器官，根系從土壤中吸收水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，并對(duì)植物起機(jī)械支撐作用[24]。2000年，Helariutta等首次在擬南芥根中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子SHR[8]，證明其參與根尖輻射形態(tài)建成，在基本組織細(xì)胞平周分裂形成過(guò)程中發(fā)揮著的重要作用，進(jìn)而其他物種的SHR基因陸續(xù)被挖掘研究[25]。本研究成功克隆獲得了中山杉406ThSHR3基因全長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ThSHR3和中山杉ThSHR1、ThSHR2高度同源，和其他物種的SHR基因一起劃分到SHR 分支，且具有植物GRAS 蛋白家族特有的結(jié)構(gòu)域，因而推測(cè)ThSHR3可能參與中山杉406不定根的發(fā)育。

木本模式植物楊樹的SHR分支基因包含3個(gè)成員：PeSHR1、PeSHR2、PeSHR3，其表達(dá)存在著2種模式，PeSHR1、PeSHR2基因表達(dá)量在根的發(fā)育過(guò)程中呈逐漸上升趨勢(shì)，根發(fā)育到4 周時(shí)表達(dá)量最高，而PeSHR3基因在根中的表達(dá)模式為先上升后下降[22]。中山杉3個(gè)SHR基因的表達(dá)特性在不定根不同發(fā)育階段是否也存在著差異？研究表明：ThSHR1呈逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì)，在根的生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，而ThSHR2表達(dá)量先上升再下降，在初生根形成期表達(dá)量最高[23]，中山杉ThSHR3和ThSHR1的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，且聚類分析發(fā)現(xiàn)二者的同源性較高，推測(cè)二者的功能可能更相近。SHR基因家族成員不同的表達(dá)模式，暗示著它們可能在根系發(fā)育過(guò)程中行使著不同的生物學(xué)功能，但也不排除它們之間存在功能冗余性，有待通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化等方法進(jìn)行深入探究。

染色體免疫共沉淀及酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，擬南芥中SCR 與SHR 互作區(qū)域在LHRI-VHIID-LHRII基序之間[15]。水稻的SHR 與SCR 蛋白也存在著互作，然而水稻的2個(gè)SHR基因OsSHR1和OsSHR2，僅發(fā)現(xiàn)OsSHR1可與OsSCR發(fā)生互作[11]。目前，關(guān)于SHR 和SCR 及其互作基因調(diào)控根部細(xì)胞不均等分裂的研究，主要集中在SHR/SCR/RBR/CYCD6-1-CDK 這信號(hào)通路中。SHR/SCR/RBR/CYCD6-1-CDK 是一條雙穩(wěn)信號(hào)回路，細(xì)胞周期蛋白CYCD6及其依賴性激酶1-CDK 共同磷酸化RBR（RING Between RING）蛋白，進(jìn)而影響SCR 蛋白活力，同時(shí)CYCD6 轉(zhuǎn)錄活性又受到SHR-SCR 復(fù)合物共同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，此通路中SHR-SCR 復(fù)合物的活性適中，才能保證根部細(xì)胞不均等分裂有序完成[15]。胥猛等利用BiFC 技術(shù)對(duì)楊樹SHR/SCR/RBR/CYCD6-1-CDK 信號(hào)通路基因的互作進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)僅PeSHR1 與PeSCR、PeSHR1 與PeCYCD6、PeSCR與PeCYCD6 三個(gè)組合發(fā)生了互作[22，26]。中山杉SHRSCR 信號(hào)通路的研究尚未開展，本研究對(duì)中山杉中新挖掘出的ThSHR3 進(jìn)行了蛋白互作研究，BiFC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中山杉ThSHR3 可以和ThSCR 發(fā)生明顯互作，推測(cè)ThSHR3 可能和ThSCR 存在于同一信號(hào)通路中，通過(guò)形成ThSHR3/ThSCR 復(fù)合體來(lái)行使轉(zhuǎn)錄功能；而ThSHR 分支上的其它成員之間以及ThSHR1、ThSHR2 與ThSCR 的互作情況仍然未知，具體的作用機(jī)制仍需通過(guò)分子生物學(xué)手段進(jìn)一步深入解析。

4 結(jié)論

本研究從中山杉406 扦插苗不定根中克隆獲得了ThSHR3基因，該基因編碼的蛋白具有GRAS家族成員特有的保守結(jié)構(gòu)域，且從屬于SHR 亞家族。ThSHR3基因在中山杉皮層休眠期、愈傷組織形成期、初生根形成期、根系生長(zhǎng)期4個(gè)時(shí)期中呈逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì)。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示：ThSHR3 蛋白和ThSCR 蛋白存在著明顯互作，而SHR-SCR 信號(hào)通路在植物根系發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，表明ThSHR3 為中山杉不定根發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步探究中山杉以及落羽杉屬樹木不定根發(fā)育的分子機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。