闞東旭，逯巖，吳江婷，陳昕，石文廣，周婧＊

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局森林培育重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

楊樹（PopulusL.）作為一種快速生長的木本植物，是我國最主要的速生豐產林樹種之一[1]。楊樹具有速生、易繁殖、適應性強和生產力高等特性，在木材加工、碳匯造林、制漿造紙和生物燃料等方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。目前，我國許多楊樹人工林種植園生長在氮素貧瘠的地區(qū)[5]，易導致楊樹人工林生產力低下，原材料利用率不高，產品質量差等問題。因此，開展楊樹根系響應氮素分子調控機制的研究，可以實現(xiàn)楊樹人工林氮素高效利用的經(jīng)濟效益，意義重大。

氮素是植物生長發(fā)育所必需的大量礦質營養(yǎng)元素之一，是蛋白質、核酸、葉綠素等重要物質的組成成分[6]。植物根系是吸收硝態(tài)氮或銨態(tài)氮的主要器官，良好的根系形態(tài)對植物氮素高效吸收利用至關重要[7]。有研究表明，植物可通過對外界不同氮形態(tài)響應做出反應，從而改變根系形態(tài)并逐漸做出相應的適應[8-12]。Wei等研究表明，楊樹根系形態(tài)對低硝態(tài)氮處理響應的初期表現(xiàn)是加快增加主根長度，隨后加速側根增殖，在低硝態(tài)氮處理2～4 d后，根系生物活性顯著增加，其根長和側根數(shù)顯著高于對照[5]。類似的動態(tài)響應在玉米(Zea maysL.)中也有報道[13]。上述研究結果表明：植物根系有能夠根據(jù)不同氮形態(tài)供應而改變其形態(tài)的能力[14]。

除植物根系形態(tài)發(fā)生變化外，分子水平調節(jié)在植物響應不同氮形態(tài)吸收同化過程中也發(fā)揮著重要作用，特別是來自具有調控功能的miRNAs 的調節(jié)[15-16]。miRNAs 是一類廣泛存在于真核生物中，長約18～24個堿基(nt)的高度保守小分子RNAs[17]。利用小RNA 高通量測序技術并結合生物信息學分析，前人研究中已鑒定出大量參與氮素吸收同化響應相關的miRNAs[16,18-19]，其中，部分miRNAs 也參與了植物根生長和發(fā)育過程[16,20-21]。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.）根中柱鞘細胞中，5 mmol·L?1硝態(tài)氮可以抑制miR167 的表達，從而提高靶基因auxin response factor 8(ARF8)的表達水平，促進擬南芥?zhèn)雀鹗己碗S后的萌發(fā)[20,22]。在水稻（Oryza sativaL.）中，miR396 的靶基因growth-regulating factor 4(GRF4) 能夠促使水稻根系吸收銨態(tài)氮從而改變水稻根系結構[23]；而miRNA 調控機制在不同氮形態(tài)處理楊樹根尖上存在怎樣的差異表達模式尚不清楚，值得深入研究。

綜上所述，本研究以灰楊(Populus×canescens)根尖為試材，利用小RNAs 高通量測序技術，分析根尖差異表達的miRNAs，并結合降解組和轉錄組測序結果，分析miRNAs 靶基因的差異表達模式，闡明楊樹根尖對硝態(tài)氮或銨態(tài)氮處理條件下miRNAs及其靶基因的表達調控機制。本研究成果可為培育氮素吸收利用效率高的林木奠定理論基礎，具有理論與實踐意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

將灰楊組培苗在組培室 (白天/黑夜溫度25℃/18℃，相對濕度50%～60%，光照長度14 h，光照強度150 μmol·m?2·s?1) 中培養(yǎng)4 周。隨后，將生根的灰楊植株種植在10 L 的花盆里進行砂培。每株植株隔天澆50 mL Long Ashton (LA)營養(yǎng)液(0.5 mmol·L?1NH4NO3、0.5 mmol·L?1KCl、0.9 mmol·L?1CaCl2、0.3 mmol·L?1MgSO4、0.6 mmol·L?1KH2PO4、42 μmol·L?1K2HPO4、10 μmol·L?1Fe-EDTA、2 μmol·L?1MnSO4、10 μmol·L?1H3BO3、7 μmol·L?1Na2MoO4、0.05 μmol·L?1CoSO4、0.2 μmol·L?1ZnSO4和0.2 μmol·L?1CuSO4,pH 5.5)。砂培植株在溫室(與組培室氣候條件相同)中培養(yǎng)14 d 后，具有相似高度(株高約30 cm)的植株被選擇并分成2 組(每組24株植物)。水培1～2 周后，將這2 組植株移植到分別添加等量氮供應的0.5 mmol·L?1NaNO3(硝態(tài)氮)和0.5 mmol·L?1NH4Cl (銨態(tài)氮) 代替0.5 mmol·L?1NH4NO3的改良LA 營養(yǎng)液中進行水培，培養(yǎng)時間為10 d。在處理10 d后對其進行根系形態(tài)特征分析，然后選取根尖40 mm 進行收獲。所有收獲樣品迅速置于液氮中，放于?80℃冰箱備用。為了獲得足夠的材料進行進一步分析，將8株植物的樣本均勻混合作為一個重復，每種處理水平3個生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 根系形態(tài)特征分析 試驗苗進行硝態(tài)氮或銨態(tài)氮處理后，對灰楊根系形態(tài)構型進行監(jiān)測，包括測量根系長度，二級可見側根發(fā)生位置等指標。

1.2.2 不同處理水平根尖小RNA 測序 不同處理水平根尖小RNAs 測序按照Illumina 公司提供的標準步驟執(zhí)行。簡單來說，將2種不同氮形態(tài)處理下的樣品，每個處理3個重復分別利用RNA 提取試劑盒提取總RNAs (TRK1001,聯(lián)川生物技術公司,杭州,中國)，將提取的總RNAs 質量檢測后，利用miRNA 特有的5′端磷酸基團和3′端羥基基團屬性，將一個腺苷化單鏈DNA 3′接頭和5′接頭相繼連接到小RNAs 上，通過與3′端互補的RT 引物進行反轉錄反應，對反轉錄產生的cDNA序列進行PCR 擴增。隨后通過6% polyacrylamideTris-borate-EDTA 切膠回收的方式對140～160 bp 長度范圍的PCR 產物進行膠回收，最后利用杭州聯(lián)川生物技術公司Illumina HiSeqTM2000 高通量測序技術進行小RNA 測序分析。

1.2.3 miRNAs 測序結果分析 將測得的RNAs 序列使用聯(lián)川生物技術公司開發(fā)的軟件進行分析。首先，去除低質量的序列，保留干凈的唯一的序列進行分析，將剩余序列比對RFam 數(shù)據(jù)庫和重復序列數(shù)據(jù)庫用以去除rRNA、tRNA、snRNA 和snoRNA等，過濾后的數(shù)據(jù)使用已有的灰楊基因組數(shù)據(jù)庫(http://aspendb.uga.edu/index.php/databases/spta-717-genome)、miRNAs 數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)進行比對，篩選出已知miRNAs。針對新的miRNAs 序列，利用miRNA 前體的標志性發(fā)夾結構，通過Mfold 軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAfold.cgi)分析RNA 二級結構，鑒定新的miRNAs。

1.2.4 miRNAs 靶基因分析 把等量的每個處理水平的3個重復樣品合并，共2個處理水平的合并樣品利用聯(lián)川生物技術公司Illumina HiSeq2500 技術平臺進行降解組測序，采用CleaveLand 軟件(3.0.1版本)預測miRNAs 的靶基因。為了進一步挖掘靶基因的表達水平，6個cDNA 文庫被構建，利用轉錄組數(shù)據(jù)Hiseq 測序平臺分析相關miRNAs 靶基因的表達模式，同時結合生物信息學Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)軟件和MapMan 軟件，分析差異表達miRNAs 靶基因的生物學功能。

1.2.5 熒光定量PCR 引物設計及合成 根據(jù)灰楊數(shù)據(jù)庫，利用Primer Premier 3.0 軟件設計引物并由上海生工生物工程有限公司合成相關miRNAs 和靶基因的引物。5.8s rRNA 和Actin 分別作為miRNAs和靶基因的內參基因。序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.2.6 統(tǒng)計分析 使用Statgraphics 軟件(STN,St Louis,MO,USA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。在進行統(tǒng)計分析之前，先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 作為統(tǒng)計意義上的顯著水平。

利用transcripts per million(TPM)對miRNAs表達水平進行定量。使用miRNA 在銨態(tài)氮處理下的TPM 除以硝態(tài)氮處理下的TPM 來計算miRNA的差異倍數(shù)(FC)。差異表達miRNAs 篩選閾值為P<0.05。

采用Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped (FPKM)對靶基因mRNAs 表達水平進行定量?；贔PKM 值，使用Ballgown package 計算mRNAs 的差異表達水平。使用mRNAs 在銨態(tài)氮處理下的FPKM 除以硝態(tài)氮處理下FPKM 來計算這個基因的差異倍數(shù)(FC)。差異表達mRNAs 篩選閾值為log2(FC) ≥1 或≤ ?1，P<0.05。

對于RT-qPCR 的測定，將qPCR 得到的Ct 值進行歸一化，計算miRNAs 及其靶基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 根系形態(tài)特征分析

由圖1 可知：在不同氮形態(tài)處理條件下灰楊根的形態(tài)特征具有顯著差別。測量表明，硝態(tài)氮處理下的根長為27.5 cm，比銨態(tài)氮處理的14.3 cm 幾乎長1 倍(p<0.001)，但2種處理水平下其二級側根發(fā)生位置比較一致。這說明不同氮形態(tài)處理對根系生長發(fā)育的影響不同。選取二級側根形成前的根尖部分(40 mm)進行后續(xù)分子實驗。

圖1 不同氮形態(tài)處理灰楊根系的表型Fig.1 Morphological parameters of P.×canescens roots with different nitrogen forms

2.2 miRNAs 深度測序數(shù)據(jù)分析

基于上述根尖形態(tài)特征分析的結果，進行高通量小RNAs 測序分析。測序結果顯示：2個處理水平的測序分別得到的原始序列讀數(shù)為5 752 458 和7 800 546，進行數(shù)據(jù)處理和雜質的過濾，去掉低質量序列和3′、5′缺失序列等，分別獲得1 996 697和2 608 788 條干凈序列(表2)。長度在18～25 nt的序列被保留下來做進一步研究。

表2 小RNA 文庫測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Distribution of small RNAs in different categories

2.3 已知和新的miRNAs 鑒定

在不同氮形態(tài)處理下，共鑒定灰楊523個已知的miRNAs 和42個新的miRNAs (表3)。研究表明，植物miRNAs 長度大多在21 nt 或22 nt，統(tǒng)計本實驗2個處理水平miRNAs 文庫中所有18～25 nt 的miRNAs 長度，21-nt miRNA 出現(xiàn)頻率最高 (圖2)，這說明該測序數(shù)據(jù)可靠。

圖2 灰楊根尖已知和新miRNAs 長度分布Fig.2 Lengths of known and novel miRNAs in root tips of P.×canescens.

表3 基于高通量測序技術鑒定灰楊根尖已知和新的miRNAs 數(shù)量Table 3 The number of identified known and novel miRNAs in root tips of P.×canescens based on high-throughput sequencing

2.4 不同氮形態(tài)處理下灰楊根尖miRNAs 差異表達

為了解不同氮形態(tài)處理下，灰楊根尖對miRNAs的響應，對篩選出來的灰楊中已知miRNAs 和新miRNAs 的表達量進行計算。分析表明：灰楊根尖共有96個miRNAs (p<0.05)在不同氮形態(tài)處理下展示出不同的表達模式，其中，包括33個已知miRNAs 家族和9個新的miRNAs。相比較于硝態(tài)氮處理，銨態(tài)氮處理有44個上調表達的miRNAs和52個下調表達的miRNAs (圖3a)，其中29個顯著差異表達的miRNAs (p<0.001)見表4。

表4 29個顯著差異表達miRNAsTable 4 twenty-nine significantly differentially expressed miRNAs

同時，隨機挑選了10個顯著差異表達miRNAs，利用RT-qPCR 進一步證實了測序結果的可靠性(圖3b)。雖然miRNAs 表達水平的差異與測序得到的差異并不一致，但上調或下調表達的趨勢是相似的。2種技術在比率方面的差異是由2種技術的算法和靈敏度的本質不同造成的?？傮w而言，本研究測序結果的可靠性較高。

圖3 不同氮形態(tài)處理條件下灰楊根尖差異表達的miRNAsFig.3 Significantly differentially expressed miRNAs in root tips of P.×canescens under different nitrogen forms treatments

2.5 不同氮形態(tài)處理下灰楊根尖靶基因的功能

為了進一步了解miRNAs 的作用，分別使用等量的總RNA 樣本對硝態(tài)氮和銨態(tài)氮2個混合降解組池進行測序，以識別miRNAs 靶基因。結果表明：分別有67.13%和65.37%去除冗余的reads 可以比對到灰楊數(shù)據(jù)庫中。從降解組中共鑒定出2729個靶基因位點，其中，2104個靶基因顯著差異表達。為了進一步了解上述靶基因的功能，對識別出的2104個顯著差異表達靶基因進行KEGG 通路分析(圖4)；同時MapMan 分析進一步揭示了這些差異靶基因在氮代謝過程中以及植物生長發(fā)育過程中參與的各種生物學過程，如ptc-miR166i-p5 有4個靶基因potri.015g017500.1/2/3/4均屬于NADH依賴的谷氨酸合成酶(NADH-dependent glutamate synthase family) 蛋白參與氮代謝過程。gra-MIR8723bp3_2ss6TC21TC 有3個靶基因Potri.003G111500.1/2/3均作為硝態(tài)氮轉運體基因(nitrate transmembrane transporter1.1/NRT1.1) 在硝態(tài)氮運輸中起到關鍵作用。ptc-MIR6462a-p5_1ss14TC 的靶基因Potri.005 G079200.1、gma-miR6300_1ss5TG和gma-miR6300_R+1_1ss5TG的靶基因Potri.001G300900.1/2均 編碼氨基酸運輸或代謝相關蛋白，也對氮代謝有所響應 (表5)；同時，與植物生長發(fā)育相關的一些miRNA的靶基因也相繼被發(fā)現(xiàn)。如miR164 家族的多個靶基因均屬于NAC基因家族成員，其在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能 (表5)。

表5 灰楊根尖氮代謝以及生長發(fā)育相關差異表達靶基因Table 5 Significantly differentially expressed target genes related to nitrogen metabolism and growth and development of P.×canescens root tips

圖4 KEGG 通路分析鑒定差異表達靶基因Fig.4 KEGG pathway analysis of significantly differentially expressed target genes

2.6 不同氮形態(tài)處理下灰楊根尖miRNAs-靶基因調控網(wǎng)絡

為了研究不同氮形態(tài)處理下，楊樹根尖差異表達miRNAs 與靶基因調控網(wǎng)絡，利用上述結果進行聯(lián)合分析。表6 表明：有23個差異表達靶基因(log2(FC)≥1或≤?1，P<0.05) 隸屬于5個miRNA家族和一個新的miRNA (P<0.05)被鑒定，且miRNA-靶基因呈現(xiàn)負相關調控關系，表明這些靶基因可能是通過miRNAs 轉錄抑制作用而被降解。

表6 不同氮形態(tài)處理條件下灰楊根尖差異表達miRNA-靶基因Table 6 Significantly differentially expressed miRNAs-target pairs in root tips of P.×canescens under different nitrogen forms treatments

通過RT-qPCR 實驗驗證了其中7個miRNA-靶基因的表達模式，結果顯示：差異表達miRNAs及其靶基因RT-qPCR 分析與高通量測序產生的表達模式相似，且表達模式呈負相關關系 (圖5)。

圖5 不同氮形態(tài)處理下miRNAs-靶基因對差異表達分析Fig.5 Validation of significantly differentially expressed miRNAs and their targets under different nitrogen forms treatments by sRNA-seq and RT-qPCR

3 討論

研究表明，基因的表達受miRNAs 調節(jié)，不同氮形態(tài)可能導致miRNAs 及其調控的靶基因差異表達，從而影響植物根尖生長和發(fā)育[24]。本研究利用高通量測序平臺研究不同氮形態(tài)處理下，楊樹根尖差異miRNAs 和靶基因的表達模式。

在不同氮形態(tài)處理10 d 后，收獲楊樹根尖40 mm 區(qū)段材料，經(jīng)過小RNA 高通量測序分析，獲得96個顯著差異表達miRNAs，其中，vvi-MIR399dp3_1ss13GA 上調表達倍數(shù)最高。前人研究表明，miR399 參與調控水稻多種營養(yǎng)饑餓反應[25]。在本研究中，miR399 靶基因為泛素化連接酶，且與miR399 呈負相關關系。有研究證明，泛素分子主要通過泛素活化酶、泛素結合酶和泛素化連接酶將靶蛋白泛素化，泛素化的蛋白最后被26S 蛋白酶體識別和降解[26]，該過程對植物營養(yǎng)缺乏等非生物脅迫發(fā)揮著重要作用[27]。因此，可以推測miR399 及其靶基因泛素化連接酶在不同氮形態(tài)脅迫響應中發(fā)揮著重要的調控作用。在本試驗條件下，部分差異表達miRNAs 與楊樹根尖生長發(fā)育相關，這與在水稻中的研究結果相似[15]。如miR171 家族成員，其靶基因之一是DELLA protein RHT-1。DELLA蛋白家族是GA 信號途徑中的負調控因子，可以抑制GA 途徑的基因表達從而抑制植物生長[28]。另有研究表明，DELLA-GRF4介導植物生長與氮代謝的協(xié)同調控機制，DELLA的積累不僅導致水稻生長矮化，而且降低了氮素利用效率[23]。在本研究中，相比較于硝態(tài)氮處理，銨態(tài)氮處理誘導miR171 靶基因DELLA表達，從而導致楊樹根尖發(fā)育受到抑制，根長變短。該研究說明楊樹根尖部分差異表達miRNAs 及其靶基因有通過對不同氮形態(tài)處理的響應而改變其根尖形態(tài)結構的能力。

對差異靶基因KEGG 通路分析表明，一些靶基因富集參與氮代謝途徑，如NADH-dependent glutamate synthase family protein和nitrate transmembrane transporter(NRT1.1) 。NADHdependent glutamate synthase family protein酶作為銨態(tài)氮吸收同化過程中的關鍵酶對植物幼苗期根系的初級銨同化很重要[29]。另有研究表明，在水稻NADH-gogat1突變體中，相比較于1 mmol·L?1硝態(tài)氮處理，1 mmol·L?1銨態(tài)氮處理抑制其根系的生長[29]，該研究結果與本研究結果相一致。相比較于硝態(tài)氮處理，銨態(tài)氮處理抑制靶基因NADH-dependent glutamate synthase family protein表達，從而導致楊樹根尖發(fā)育受到抑制，這表明NADH-dependentglutamate synthase family protein 可能在植物根尖響應不同氮形態(tài)時發(fā)揮重要的作用。NRT1.1作為硝態(tài)氮轉運體對硝態(tài)氮的反應范圍廣泛，從初始硝酸鹽反應到長期發(fā)育變化，且對側根發(fā)育的影響發(fā)揮著重大作用，即NRT1.1在低濃度硝態(tài)氮條件下抑制側根生長，而在高濃度硝態(tài)氮條件下促進植物側根生長[30]，該結論與本文研究結果一致。在本研究中，相比較于硝態(tài)氮處理，銨態(tài)氮處理下靶基因NRT1.1上調表達，抑制了楊樹側根的伸長生長。另外，對灰楊根尖氮代謝以及生長發(fā)育相關差異表達靶基因進行MapMan 分析表明，NAC基因家族出現(xiàn)頻率最多。在擬南芥中，NAC4基因作為protein auxin signaling F-BOX 3(AFB3)的下游基因，參與硝態(tài)氮響應，從而影響根系形態(tài)結構[31]。在小麥中，TaNAC2-5A可直接結合硝酸鹽轉運體和谷氨酰胺合成酶基因的啟動子區(qū)域，過表達TaNAC2-5A可促進小麥根系生長和硝酸鹽流入[32]。在本研究中，相比較于銨態(tài)氮處理，硝態(tài)氮處理中NAC1基因高表達，從而促進根生長，這一結論與前人的研究結果相一致。

在聯(lián)合分析中，共發(fā)現(xiàn)24 對miRNA-靶基因呈負相關關系，其中，miR396-GRF是聯(lián)合分析中出現(xiàn)最多的一組關系對。GRF4作為miR396 的靶基因能夠驅動水稻根對銨態(tài)氮的吸收[23]，同時GRF4能夠驅動硝態(tài)氮轉運體的轉錄水平，例如NRT1.1B和NRT2.3a、GRF4還能夠驅動硝態(tài)氮同化酶基因nitrate reductase 1(NIA1)、NIA3和nitrite reductase 1(NiR1)的合成從而去調節(jié)氮代謝，且在水稻中，GRF4突變抑制植物生長[23]。在本研究中，相比較于硝態(tài)氮處理，在銨態(tài)氮處理中miR396下調表達，其靶基因GRF1/2/5/9均上調表達，從而促進楊樹根生長，這一結論與前人的研究結果相一致。該結果說明miR396-GRF在不同氮形態(tài)脅迫響應中發(fā)揮著重要的調控作用。另外，表達差異最顯著的靶基因為新miRNAPC-3p-42422_177 的3個靶基因，但其功能未知，有待進一步研究證實。

4 結論

本研究從2種不同氮形態(tài)處理楊樹根尖miRNAs文庫中鑒定出523個已知miRNAs 和42個新miRNAs，其中，有96個miRNAs 顯著差異表達。與硝態(tài)氮處理相比，銨態(tài)氮處理下有44個miRNAs 上調表達，52個下調表達，其中，miR396-GRF模塊引起筆者的關注。研究表明，miR396-GRF模塊可能通過響應不同氮形態(tài)調控楊樹根系形態(tài)構型。該研究不僅可以為我國轉基因楊樹研究儲備基因資源信息，還可以加快氮吸收能力強的楊樹優(yōu)質速生良種的培育。