韓長志，祝友朋，王韻晴

(1.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224；2.云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

核桃作為世界著名的“四大干果”（核桃、扁桃仁、腰果、榛子）之一，是重要的經濟林樹種之一[1]。近些年，云南省所轄129個縣（市、區(qū)）中90%以上地區(qū)大力發(fā)展核桃產業(yè)，2017年種植面積（近300 萬hm2）、產量（115 萬噸）、產值（315億元）均居全國之首[2]。然而，核桃炭疽病、細菌性黑斑病等病害嚴重影響著云南省核桃產業(yè)的健康、有序和快速發(fā)展[3-4]。

核桃細菌性黑斑病，又名核桃黑斑病、核桃黑、黑腐病，作為一種細菌性病害，是世界性的核桃病害，核桃植株受害率高達90%以上[5-6]。主要危害核桃果實、葉片、嫩梢、芽、雄花序及枝條等[7]，幼果受害后果皮表面形成褐色軟斑，后變黑腐爛，造成落果[8]；成熟果實受害后會造成果皮形成黑色病斑[9]；葉片受害后出現(xiàn)小褐斑，后病斑脫落；嫩梢受害后病斑褐色，凹陷，嚴重時病斑以上部分嫩梢枯死，嚴重影響著核桃的產量和品質。核桃種植地因所處環(huán)境不同和核桃品種不同，核桃細菌性黑斑病的危害程度也存在差異，如甘肅天水市發(fā)生該病的病株率為9%～45%，果實被害率14%～60%，造成減產15%～40%[10]，河南濮陽縣發(fā)生該病的病株率為60%～100%，果實被害率30%～70%，核仁減重40%～50%[11]，濟南市南部山區(qū)2017年發(fā)生該病的病株率約42%，減產約40%[12]等。

目前，國內外學者關于核桃細菌性黑斑病的研究，主要集中在病害癥狀、病原、侵染循環(huán)、檢測技術、預測預報技術[13]、發(fā)病規(guī)律及防治[14-16]等方面。為了更好地解析核桃細菌性黑斑病菌的致病機理以及研發(fā)防治該病害的作用靶標藥劑，本研究基于文獻計量法，通過對國內外文獻數(shù)據(jù)庫中有關該病的文章開展深入剖析，針對該病害研究的薄弱點，從宏觀視角和微觀視角對核桃細菌性黑斑病的未來研究提出展望，以期為該病害的進一步研究及有效控制提供參考。

1 國內外文獻計量分析

為明確近年來學術界對核桃細菌性黑斑病的研究現(xiàn)狀，選用國內CNKI 數(shù)據(jù)庫及國外Sciencedirect 數(shù)據(jù)庫，分別采用“主題”、“篇名”進行“核桃細菌性黑斑病”及“Walnut Blight”檢索，并對2009—2019年的文獻進行整理。結果表明，近10年來國內外學者關于核桃細菌性黑斑病的研究報道均呈上升的趨勢，但此病菌引起的病害在國內外的文獻報道數(shù)量較少（圖1）。通過對上述文獻的梳理，發(fā)現(xiàn)前人的研究主要集中在該病害的發(fā)生與防治，涉及病害的防治有131 篇、發(fā)生有53 篇、防治方法25 篇、發(fā)病規(guī)律19 篇、病原有18 篇、發(fā)生原因有10 篇、藥劑防治試驗10 篇、危害癥狀7 篇、不同品種抗性3 篇等。關于該菌的研究尚缺乏諸如分泌蛋白、致病因子等分子生物學方面的研究以及病菌檢測、致病性測定、侵染機制等常規(guī)性的研究報道。

圖1 國內外學者關于核桃細菌性黑斑病的文獻計量分析Fig.1 Bibliometric analysis of the bacterial black spot disease of walnut by domestic and foreign scholars

2 核桃細菌性黑斑病病原

2.1 種類和地區(qū)分布不盡相同

目前，國內外學者關于引起核桃細菌性黑斑病的病原報道主要涉及樹生黃單胞菌胡桃變種（Xanthomonas arboricolapv.juglandis）[10,17-19]、核桃黃極毛桿菌（Xanthomonas campestrispv.juglandis）[20-21]、成團泛菌（Pantoea agglomerans）以及上述細菌的復合報道[22]，韓國地區(qū)為變黃假單胞菌（Pseudomonas flavescens）[23]。此外，畢節(jié)地區(qū)、甘肅天水市、云南香格里拉的病原報道為核桃黃極毛桿菌[Xanthomonas juglandis（Pierce）Dowson][24-26]。但X.arboricola、X.campestris和X.juglandis（Pierce）Dowson 三者的關系尚不明確，前人研究認為核桃細菌性黑斑病的病原為核桃黃極毛桿菌，僅是命名不同，最開始命名為X.campestrispv.juglandis（Pierce ）Dye，后來被命名為X.arboricolapv.juglandis（Pierce）Vauterin，我國一開始將核桃細菌性黑斑病的病原命名為X.juglandis（Pierce）Dowson，后改為X.campestris，現(xiàn)在多命名為X.arboricola[13]。陳善義團隊對北京地區(qū)核桃細菌性黑斑病的病原進行16S rDNA 序列測序，然后進行BLAST 比對發(fā)現(xiàn)與X.campestris及X.arboricola的一些致病變種的相似性為99%[27]。X.campestris和X.arboricola是否為同一種菌的不同致病變種有待進一步明確。

關于核桃細菌黑斑病的報道主要集中在四川、山東、甘肅、云南等核桃主要種植地區(qū)，盡管一些地區(qū)關于該病害的病原報道相同，但各個地區(qū)病原形態(tài)大小存在一定的差異性。在云南，X.arboricola的形態(tài)大小為0.5～1.2 μm×1.0～2.4 μm[22]，該病菌未見其他地區(qū)報道；在甘肅隴南市，X.campestris的形態(tài)大小為1.3～3.0 μm×0.3～0.5 μm[28]，在臨夏州臨夏縣，形態(tài)大小為1.25～3.1 μm×0.3～0.4 μm[29]，在山東，形態(tài)大小為0.3～1.8 μm×0.3～0.8 μm[30]，該病菌未見其他地區(qū)報道。在云南，P.agglomerans的形態(tài)大小為0.5～2.0 μm×0.6～3.0 μm[22]，在隴南，形態(tài)大小為1.0～3.0 μm×0.5～1.0 μm[31]，在山東，形態(tài)大小為0.9～3.0 μm×0.6～1.2 μm[30]（表1）。

表1 核桃細菌性黑斑病病原的種類和地區(qū)分布Table 1 Species and regional distribution of walnut bacterial black spot

2.2 分離和鑒定方法基本一致

前人對核桃細菌性黑斑病的鑒定，主要根據(jù)病菌的菌落特征和生理生化特征，以及致病性試驗驗證等。2011年陳善義團隊對北京地區(qū)的核桃細菌性黑斑病菌進行16S rDNA 序列的測定，鑒定病菌為X.campestris，從分子角度進行核桃細菌性黑斑病菌的鑒定和分類提供依據(jù)[27]。2020年Hyun-Sun Kim等人根據(jù)菌落特征、16S rRNA 序列測定并構建系統(tǒng)進化樹、致病性驗證，鑒定核桃細菌性黑斑病菌為Pseudomonas flavescens[23]。目前，對核桃細菌性黑斑病菌的鑒定依據(jù)主要為菌落特征、生理生化特征、致病性驗證和分子特征等（表2）。

表2 核桃細菌性黑斑病的病原報道及鑒定方法Table 2 Reported pathogen and identification method of walnut bacterial black spot

3 侵染循環(huán)及發(fā)病條件

3.1 侵染循環(huán)

核桃細菌性黑斑病的病原菌一般在核桃休眠芽、雄花芽內越冬，少部分在僵果、病果、病枝、潰瘍斑及昆蟲體上越冬；翌年春天，伴隨著核桃芽和雄花序的生長，病原菌不斷繁殖，進而侵染其周圍的健康組織，形成初侵染[35]。同時，該菌可以通過核桃組織中的氣孔、皮孔、柱頭等自然孔口，或是通過昆蟲、日灼、冰雹等造成的傷口進一步侵染核桃葉片、枝條以及果實，形成再侵染；其傳播一般借助于雨水、灌溉水、介體昆蟲、農事操作、帶菌的苗木及接穗等（圖2）。在河北太行山區(qū)一般5月中下旬開始發(fā)生，6—7月為發(fā)病盛期[36]，北京地區(qū)發(fā)病盛期在7月下旬至8月中旬雨季，若夏季多雨發(fā)病加重，夏季干旱少雨年份發(fā)病輕[27]。就成團泛菌而言，其主要通過傷口侵入植株葉片組織使得核桃發(fā)病，而植株莖干的損傷對植株發(fā)病短期內無明顯影響。

圖2 核桃細菌性黑斑病的病害循環(huán)Fig.2 Disease cycle of walnut bacterial black spot

3.2 發(fā)病條件

核桃細菌性黑斑病的危害程度受環(huán)境濕度影響較大，在濕潤多雨的季節(jié)、年份發(fā)病嚴重[37]。展葉期、花期前后、幼果期等核桃生長期若處于多雨潮濕的環(huán)境中，將有利于病原菌的侵染和存活，因此在核桃細菌性黑斑病的防治中展葉期和花期等初侵染時期是防治的關鍵時期。病菌一般5月中下旬開始侵染果實、枝條、葉片和幼嫩組織，7月下旬到8月中旬為發(fā)病盛期。同時前人調查發(fā)現(xiàn)不同品種、樹齡、樹勢發(fā)病輕重也不相同，引入核桃發(fā)病情況重于當?shù)睾颂襕38]，種植在背陰處、濕度較大的地方的核桃發(fā)病較重，樹勢衰弱的核桃發(fā)病較重，蟲害嚴重的片區(qū)，如核桃舉肢蛾（Atrijuglans hetaohei）攜帶病原菌進行傳播，有利于病害的流行，云斑天牛（Batocera horsfieldi）、核桃小吉?。ˋgrilus lewisiellus）等枝干害蟲造成的傷口，有利于病菌的侵入，易造成核桃發(fā)病較重[39]。此外還與核桃樹體郁閉通風透氣度、立地條件、栽培管理措施及防治不當有很大的關系[37]。

4 防治措施

核桃細菌性黑斑病的防治主要有農業(yè)防治和化學防治兩種，農業(yè)防治應以種植抗病品種為主[40]，另外在核桃的種植過程中可以和豆科植物套種[41]，改善田間小氣候；合理的種植密度，保證通風透光度；加強水肥管理，增強核桃樹勢；清除病枝、病果等，減少病源；采收時減少棍棒敲擊，以免造成大傷口，減少病原菌侵染機會等[42]?；瘜W防治主要有預防和防治兩方面，其中預防主要采用波爾多液等[43]，防治主要采用銅制劑、代森類藥劑和抗生素類藥劑在核桃生長的不同時期進行防治[16,44-46]，其中趙寶軍等人發(fā)現(xiàn)施用春雷菌素 + 代森錳鋅的混合藥劑，防治效果為90.94%，其次為代森鋅，防治效果為80.49%，但農用硫酸鏈霉素防治效果不佳[16]；郭安柱等人發(fā)現(xiàn)中生菌素、噻霉酮、氟啶胺和春雷菌素對成團泛菌的防治效果都在70%以上[44]；劉寶生等人發(fā)現(xiàn)施用農用硫酸鏈霉素 + 乙蒜素的混合藥劑，防治效果為100%，中生菌素、四霉素和農用硫酸鏈霉素的防治效果都在95%以上[45]；孫陽發(fā)現(xiàn)農用硫酸鏈霉素、可殺得3000、代森錳鋅、春雷王銅和吡蟲啉混合施用，防治效果可以顯著提高[46]；陳邦清等人發(fā)現(xiàn)可以滅殺真菌和細菌的氟硅唑和農用硫酸鏈霉素的防治效果高于多菌靈和可殺得3000，與毒死蜱混合施用的防治效果高于單一施用[47]。因此，在對核桃細菌性黑斑病進行防治時，化學藥劑應施用銅制劑 + 代森類、抗生素類 + 代森類等類型的混合藥劑，還要進行病蟲害的綜合防治，以達到最大的防治效果[47-48]。

5 展望

5.1 核桃細菌性黑斑病菌的致病因子及分泌蛋白研究是未來的研究熱點

近些年，學術界對植物病原真菌、卵菌等真核生物分泌蛋白的預測較多，而對屬于植物病原細菌特別經濟林木上的植物病原細菌研究較少[49]。本研究小組明確核桃細菌性黑斑病菌Xanthomonas arboricolapv.Juglandis的7個菌株[50-51]中分泌蛋白數(shù)量僅占全蛋白數(shù)量的1.81%。不僅與前人所報道的有關植物病原真菌、細菌、卵菌分泌蛋白所占比例存在明顯差異，也與放線菌中分泌蛋白所占比例存在明顯差異[52]。分泌蛋白可以作為效應物參與病原菌的侵染過程，其中碳水化合物活性酶類（CAZymes）是分泌蛋白的重要類型，在碳水化合物的降解過程中發(fā)揮著重要作用，參與植物細胞壁的降解，在病原菌的侵染過程中發(fā)揮著重要作用。今后深入解析核桃細菌性黑斑病菌中分泌蛋白的功能及其致病機理，將有助于更好地開發(fā)針對其致病基因或蛋白的作用靶標的藥劑，更好地實現(xiàn)對核桃細菌性黑斑病的有效防控，有助于進一步促進核桃產業(yè)健康、有序、快速發(fā)展。

5.2 核桃細菌性黑斑病菌的致病機制和寄主植物的抗病機制及其互作機制研究是未來的研究難點

近些年，引起核桃細菌性黑斑病菌的報道主要涉及X.arboricola、X.campestris，筆者在美國國立衛(wèi)生院（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行病菌拉丁文搜索，獲到X.arboricola和X.campestris相關報道的多個菌株的全基因組序列，由此推斷上述病原菌對于植物的危害在世界各地表現(xiàn)較為突出。因此，學術上急需明確有關植物病原菌的致病機制，從而更好地實現(xiàn)對于該病害的防治。同時，國外學者利用多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析方法（Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis,MLVA）進一步開展了核桃細菌性黑斑病菌的致病變種間的遺傳關系研究[53]，然而，對于X.arboricola和X.campestris之間的遺傳關系尚不清楚。此外，就不同區(qū)域上述植物病原菌之間的遺傳關系也不清楚，以及植物病原菌與寄主植物的抗病機制以及互作機制也不清楚，均有待于今后學術界對其開展更加深入的研究。

5.3 核桃細菌性黑斑病的早期檢測預警及全程綠色防控技術研究是未來的研究重點

核桃細菌性黑斑病目前國內尚未見相關預測預報模型的報道。2000年，美國針對細菌性黑斑病的發(fā)生發(fā)展，開展了預測預報模型的構建工作，商業(yè)上稱為Xanthocast TM，現(xiàn)已廣泛應用于美國核桃生產和科學研究中。因此，開展核桃細菌性黑斑病早期快速檢測預警技術是病害科學防治的重點，目前核桃細菌性黑斑病的診斷判定一般是依據(jù)田間癥狀和病原菌的培養(yǎng)特征。通過培養(yǎng)基培養(yǎng)后進行鏡檢[29]，輔以分子檢測技術，提高核桃細菌性黑斑病診斷的準確性及效率，但耗時較長。國外采用一種微流控免疫傳感器，將檢測樣本中氨基苯基磷酸酯通過堿性磷酸酶轉化為對氨基苯酚，利用酶產物產生的電流大小與病原菌成正比來實現(xiàn)對于病原菌的檢測[54]。實時熒光定量PCR 是一種普遍的植物病原菌檢測方法，其實用性、可靠性較高，該技術可用于未來核桃細菌性黑斑菌的檢測工作中。在病害防治方面，應針對核桃產區(qū)環(huán)境條件、品種特性、栽培管理方式等存在的差異，制定適宜的科學防治方法，在藥劑選用上，應逐步減少化學藥劑的大量使用，采用生物防治、無公害技術等綠色防控方法。