王天翼，徐 悅，王羅云，張建國，曾艷飛

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091)

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn.），又名醋柳、酸刺、黑刺等，屬胡頹子科（Eleagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是二倍體（2n=24），落葉灌木或小喬木，雌雄異株，風(fēng)媒傳粉；主要分布于歐亞大陸，集中在溫帶和寒溫帶地區(qū)，生態(tài)幅極廣[1-4]。沙棘具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，在開發(fā)保健食品、藥品和化妝品上有著獨特的作用，還是很多偏遠(yuǎn)地區(qū)脫貧致富的經(jīng)濟(jì)來源。更重要的是，沙棘具有很高的生態(tài)價值，被廣泛應(yīng)用在治理荒漠化、退耕還林、植被綠化等方面[4-5]。

沙棘共包括了9個亞種[2-3]，起源于青藏高原，后多次擴散至亞歐大陸其他地區(qū)[6]，其中，中國沙棘（H.rhamnoidessubsp.sinensis）和云南沙棘（H.rhamnoidessubsp.yunnanensis）是我國特有的沙棘亞種。中國沙棘葉常近對生，成狹披針形或矩圓披針形，葉背面銀白色、被鱗片，從西南到東北都有自然種群分布[7]，同時它也是我國栽培和種植歷史最悠久的一個亞種[8]。云南沙棘葉互生，基部最寬，常為圓形或有時楔形，葉背面灰褐色、被銹色鱗片，其分布范圍相對狹窄，多分布于西藏、四川和云南的交界地帶[7]。依據(jù)國家植物標(biāo)本資源庫（http://www.cvh.ac.cn/）、Global Biodiversity Information Facility（GBIF，https://www.gbif.org/）、國家資源標(biāo)本平臺（http://nsii.org.cn/2017/）和相關(guān)沙棘研究文獻(xiàn)等資料記載的沙棘分布點，中國沙棘和云南沙棘在地理上有分類存在疑問的區(qū)域，主要集中在四川省北部和中西部。中國沙棘和云南沙棘形態(tài)相似，并且具有不完全譜系分選，親緣關(guān)系較近，區(qū)分難度較大[8]。判定該區(qū)域種群基因流的變化、種群間的分界線，有利于明確遺傳擴散適應(yīng)機制[9]。目前，有關(guān)中國沙棘和云南沙棘譜系地理的研究文獻(xiàn)以及標(biāo)本資源庫對于四川省北部和中西部沙棘的種類歸屬問題存在一定的分歧[8,10-11]。

本研究中，筆者利用18個SSR 標(biāo)記對來自32個自然種群的352個中國沙棘和云南沙棘個體和沙棘屬其他種和亞種的75個個體進(jìn)行遺傳變異分析，以期探討以下問題：（1）中國沙棘和云南沙棘是否存在明顯的遺傳分化？二者的物理分界線在哪？（2）中國沙棘和云南沙棘的遺傳多樣性分布如何？

1 材料與方法

1.1 樣本采集

從中國沙棘和云南沙棘的典型分布地區(qū)和分類存疑地區(qū)采集了32個自然種群，共352個個體。因沙棘存在克隆繁殖，為了避免取到同一基因型個體，采集時不同樣品間至少間隔200 m。對所采集的個體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以便初步定種，并記錄定位（表1）。為了明確中國沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，還收集了沙棘屬其他種及亞種分別5～10個共75個個體用于分析（表1），包括蒙古沙棘（H.rhamnoidessubsp.mongolica）、溪生沙棘（H.rhamnoidessubsp.fluviatilis）、高加索沙棘（H.rhamnoidessubsp.caucasica）、中亞沙棘（H.rhamnoidessubsp.turkestanica）、海濱沙棘（H.rhamnoidessubsp.rhamnoides）、西藏沙棘（H.tibetana）、肋果沙棘（H.neurocarpa）、棱果沙棘（H.goniocarpa）、江孜沙棘（H.gyantsensis）、柳葉沙棘（H.salicofolia）。所有收集到的葉片均用變色硅膠干燥保存。

表1 沙棘種群采樣信息Table 1 Sampling information of sea buckthorn populations

1.2 DNA 提取和SSR 基因型檢測

葉片總DNA 的提取采用CTAB 植物基因組DNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物公司）。從沙棘基因組和轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR 分子標(biāo)記[12]中選取18 對對所有個體進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)總體系為20 μL，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照王羅云等[13]的工作進(jìn)行。

用ABI 3730 測序儀（美國生命技術(shù)公司）對PCR 產(chǎn)物分析，內(nèi)標(biāo)選擇Liz500，結(jié)果經(jīng)由軟件Genemapper 4.0（美國生命技術(shù)公司）分析，對于SSR 基因型完全一致的潛在克隆株個體僅保留一份樣品，所得到數(shù)據(jù)均以大果沙棘品種“向陽”為陽性對照。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

兩兩樣品間的遺傳距離由軟件MSA 4.05[14]計算，再用Phylip 3.695[15]軟件中的Neighbor 程序?qū)λ猩臣瑐€體以及中國沙棘和云南沙棘分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值設(shè)置成1 000 次。

1.4 遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3[16]軟件確定所采集中國沙棘和云南沙棘個體的遺傳分組情況。采用混合模型和等位基因頻率關(guān)聯(lián)模型，分組值K設(shè)置為1～10，每個K值重復(fù)計算10 次，每次運行100 000 次Burnin和1000000次迭代[13]。將結(jié)果上傳到Structure Harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHa rvester/）中，根據(jù)lnP（D）和ΔK最大原則[17]選擇合適的K值，再通過Distruct 1.1[18]將結(jié)果可視化。

1.5 遺傳多樣性和遺傳分化分析

利用軟件GenAlEx 6.503[19]，計算中國沙棘和云南沙棘種群的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因個數(shù)NA、有效等位基因個數(shù)NE、觀測雜合度HO、期望雜合度HE和近交系數(shù)FIS。利用MSA 4.05[14]計算遺傳分化系數(shù)FST，并進(jìn)行分子方差分級分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）。

2 結(jié)果

2.1 中國沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)

基于SSR 基因型構(gòu)建的沙棘屬的5個種和7個亞種的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖1A）顯示：所有的中國沙棘都聚為一大支，而云南沙棘個體主要聚為4 支；除一支及少量個體與中國沙棘聚在一起外，其他3 支都和中國沙棘距離較遠(yuǎn)，其中，1 支由12個云南沙棘個體（圖1A 虛線部分）組成的分支與沙棘屬的其他4個種——西藏沙棘、肋果沙棘、江孜沙棘和柳葉沙棘聚在一起，這12個個體包括來自BS種群1個、XZD種群1個、XJ種群1個、BX種群7個、WL種群2個。中國沙棘和云南沙棘的個體單獨構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1B）顯示：除6個云南沙棘個體（LX種群2個、LTB種群2個、CY種群1個、BS種群1個）與中國沙棘種群交叉聚在一起外，其余個體明顯地分為2 部分，各分支支持率大都不高（小于50%）；云南沙棘個體可分為a、b 2 支，其中，a 支為種群的個體與中國沙棘聚在一起，b 支為西藏、云南和四川中南部與中國沙棘距離較遠(yuǎn)；中國沙棘各分支支長較短，差異不明顯，云南沙棘各分支支長較長，遺傳距離較遠(yuǎn)。

利用Structure 2.3[16]軟件，基于中國沙棘和云南沙棘個體SSR 基因型的分組分析顯示：lnP（D）在K= 2 時迅速增高，K>2 后趨于平緩（圖2A）；ΔK在K= 2 時有明顯峰值（圖2B）。因此，所有個體分2 組最合適，對應(yīng)與按初步形態(tài)分為中國沙棘和云南沙棘2個亞種（圖2C）。位于四川的MWS 和QY 2個種群的大部分個體表現(xiàn)為這2 組的中間基因型（圖2C），因此，后續(xù)分析將把MWS、QY 作為中間型種群。

2.2 中國沙棘和云南沙棘的遺傳多樣性

基于18個SSR 位點的中國沙棘遺傳多樣性參數(shù)（表2）表明：NA為1.7～4.9（平均3.5），NE為1.4～2.7（平均2.3），HO為0.213～0.528（平均0.402），HE為0.266～0.539（平均0.462）?；?8個SSR 位點的云南沙棘遺傳多樣性參數(shù)如下（表2）表明：NA為1.4～4.2（平均2.7）、NE為1.3～2.4（平均1.8）、HO為0.056～0.331（平均0.202）、HE為0.127～0.490（平均0.334）。中國沙棘和云南沙棘中HO最高的種群分別是YY 和KD，最低的種群分別為TW和PM。中國沙棘的NA、NE、HO、HE均值均高于云南沙棘。

2.3 中國沙棘和云南沙棘的遺傳分化

基于18 對SSR 標(biāo)記，中國沙棘兩兩種群間的FST為0.026～0.286，分化程度最低的為種群CFA和WC，分化程度最高的為種群TW 和HY；云南沙棘兩兩種群間的FST為0.069～0.539，分化程度最低的為種群LX 和SJS，分化程度最高的為種群LZ 和SJS；云南沙棘的FST值、FIS值普遍高于中國沙棘（表2、3）。AMOVA 分析顯示（表4）顯示：中國沙棘和云南沙棘亞種間遺傳變異占比為23.7%，亞種內(nèi)不同種群間占23.3%，種群內(nèi)個體間占53.0%。中國沙棘25.5% 的遺傳變異來自種群間，74.5%的遺傳變異來自種群內(nèi)個體間；云南沙棘種群36.7%的遺傳變異來自種群間，63.3%的遺傳變異來自種群內(nèi)個體間。

表2 本研究分析的30個沙棘種群的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 The genetic diversity of 30 sea buckthorn populations

表3 中國沙棘（對角線左下方）和云南沙棘（對角線右上方）亞種內(nèi)不同種群間遺傳分化系數(shù)（FST）Table 3 Genetic differentiation coefficients (FST) between populations within H.rhamnoides subsp.sinensis (below diagonal) and within H.rhamnoides subsp.yunnanensis (above diagonal),respectively.

表4 中國沙棘和云南沙棘基于SSR 基因型的AMOVA 分析Table 4 AMOVA analysis based on SSR genotypes of H.rhamnoides subsp.sinensis and H.rhamnoides subsp.yunnanensis

3 討論

3.1 中國沙棘和云南沙棘的“邊界線”

依據(jù)標(biāo)本、文獻(xiàn)資料的記載，在四川省部分地區(qū)，中國沙棘和云南沙棘的分類存在爭議。本研究基于18個SSR 位點的基因型，系統(tǒng)發(fā)育樹和Structure 2.3[16]軟件分組結(jié)果都顯示，中國沙棘和云南沙棘可分成明顯的2 組，種群MWS 和QY 的大部分個體表現(xiàn)為2 組間雜交。這2個種群分別位于四川北部的紅原縣和松潘縣，該區(qū)域北側(cè)種群的遺傳組成中含更多的中國沙棘遺傳成份，南側(cè)種群的遺傳組成中含更多的云南沙棘遺傳成份，因此，推測該地區(qū)為中國沙棘和云南沙棘的分布邊界帶。Wang等[8]利用葉綠體片段序列研究中國沙棘的空間遺傳分布時，發(fā)現(xiàn)重疊分布區(qū)的中國沙棘的2個單倍型也存在于云南沙棘中，并且單倍型在若爾蓋盆地有明顯的分界。這與本研究確定的分布邊界帶區(qū)域相符，這一結(jié)果可為沙棘的物種鑒定分類提供初步依據(jù)。要進(jìn)一步確定分界線的地理位置，還需要更多的數(shù)據(jù)，如形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)、地形數(shù)據(jù)、氣候數(shù)據(jù)等。

中國沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育樹中，分支支持率低，可能存在種間雜交；同一亞種內(nèi)部各分支支持率大多不高，同一地理種群個體并不能完全聚在一起，說明地理種群間存在基因流；Structure 結(jié)果也表明，亞種間有基因漸滲現(xiàn)象，這與前人研究結(jié)果一致[6,11]。中國沙棘與云南沙棘親緣關(guān)系較近，亞種間和種群間可能存在基因交流。但要進(jìn)一步明確基因交流的程度，還需要更多的SSR 位點等遺傳信息的支持，以及覆蓋范圍更廣的樣品收集。

3.2 中國沙棘和云南沙棘的遺傳分化和遺傳多樣性

孫坤等[20]利用ISSR 標(biāo)記研究了不同海拔中國沙棘的遺傳變異情況，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生遺傳分化的主要原因可能是基因流受限。本研究中，依據(jù)AMOVA和遺傳分化系數(shù)，發(fā)現(xiàn)云南沙棘的遺傳分化程度高于中國沙棘，造成這一結(jié)果的主要原因可能是云南沙棘采集自四川、云南、西藏等地形復(fù)雜地區(qū)，復(fù)雜的地形和氣候使種群間的基因交流受限。另一個可能是，某些地區(qū)的云南沙棘種群可能與某種沙棘，如肋果沙棘[2]，存在種間雜交，雜交后代的存在或雜交導(dǎo)致的基因漸滲使得這些種群與其他地區(qū)的云南沙棘種群的遺傳差異升高。

沙棘被推測為起源于青藏高原地區(qū)，青藏高原的隆升和第三紀(jì)氣候影響了它的分布范圍和多樣性，而后擴散到歐洲和中國其他地區(qū)[11,21]。中國沙棘在我國境內(nèi)分布廣，從西藏、云南到遼寧、內(nèi)蒙均有自然種群分布，生境差異較大。通常分布范圍廣的物種有著更高的遺傳多樣性，而遺傳多樣性越高，越能為其適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境提供有力支持[22-24]。本研究中，中國沙棘的各項遺傳多樣性參數(shù)均高于云南沙棘，代表中國沙棘的遺傳多樣性高于云南沙棘種群，這與前人研究結(jié)論一致[8,13]，這可能是由于中國沙棘相較于云南沙棘分布范圍廣。

4 結(jié)論

本研究探討了中國沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中國沙棘的遺傳多樣性高于云南沙棘，與前者更廣泛的分布范圍有關(guān)；云南沙棘種群的遺傳分化程度高于中國沙棘種群，推測是復(fù)雜的高山地形限制了云南沙棘種群間的基因交流，或區(qū)域性種間雜交漸滲提高了不同地理種群間的差異；確定了中國沙棘和云南沙棘的分布邊界位于四川北部的紅原縣、松潘縣一帶。本工作為中國沙棘和云南沙棘遺傳資源的保護(hù)和利用提供了重要的基礎(chǔ)。