譚 磊,陳明月,沈 彬
南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 211166
CRISPR?Cas系統(tǒng)是細(xì)菌、古細(xì)菌對抗病毒進(jìn)化出來的免疫機(jī)制,2012 年,首次將CRISPR?Cas9 系統(tǒng)成功應(yīng)用于大腸桿菌基因組編輯[1],隨后這一系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用到哺乳動物和人類細(xì)胞中[2],從此基因編輯進(jìn)入了新時(shí)代。目前已知的絕大部分疾病是由堿基突變導(dǎo)致的,為了構(gòu)建疾病模型或者修復(fù)致病突變,基于CRISPR?Cas9 系統(tǒng)的堿基編輯器應(yīng)運(yùn)而生,可以實(shí)現(xiàn)A·T 到G·C 和C·G 到T·A 的突變,最近出現(xiàn)的先導(dǎo)編輯器(Prime editors)可實(shí)現(xiàn)12種單堿基的任意替換、短片段的刪除和插入[3]。雖然CRISPR?Cas9 技術(shù)日趨完善,但將其廣泛應(yīng)用于臨床基因治療還存在一定的風(fēng)險(xiǎn),其在特異性、安全性和在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方面仍有待提升。
野生型SpCas9 存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[4],為了降低這一系統(tǒng)的脫靶活性,多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對其進(jìn)行了優(yōu)化。利用Cas9切口酶和雙sgRNA[5],或者利用失活Cas9融合Fok1和雙sgRNA 都可以顯著降低脫靶[6]。對sgRNA 的改造也可用來增加特異性,比如截短sgRNA(Truncated sgRNA)[7]和發(fā)卡sgRNA(haripin?sgRNA)[8]等?;贑as9 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化可以在降低脫靶效應(yīng)同時(shí)保持較高的編輯活性。Slay?maker 等[9]通過丙氨酸掃描技術(shù),開發(fā)了eSpCas9(1.1),這種Cas9 變體降低了Cas9 與非互補(bǔ)鏈DNA的親和力。利用類似的原理,Kleinstiver 等[10]開發(fā)了高保真突變體SpCas9?HF1。Chen 等[11]利用eSp?Cas9(1.1)和SpCas9?HF1 在與非靶向序列結(jié)合時(shí)會轉(zhuǎn)換成非活躍狀態(tài)的機(jī)制對野生型Cas9 進(jìn)行氨基酸突變,獲得了兼具高切割活性和低脫靶活性的HypaCas9。Casini 等[12]在酵母上對Rec3 結(jié)構(gòu)域突變的SpCas9 文庫進(jìn)行篩選,鑒定出了四重突變體evoCas9,盡管這一突變體特異性很高,但也極大地降低了編輯活性。Lee 等[13]利用大腸桿菌篩選出Sniper?Cas9,在降低脫靶活性的同時(shí),也能保持與野生型SpCas9相當(dāng)?shù)木庉嫽钚浴?/p>
相對于野生型SpCas9 的編輯活性,絕大部分Cas9 高保真突變體的基因編輯活性均下降,雖然Sniper?Cas9 保持了和野生型Cas9 相當(dāng)?shù)幕蚓庉嫽钚?,但是特異性比其他突變體低[14]。因此,開發(fā)高活性和高特異性的突變體Cas9勢在必行。
基因編輯技術(shù)的深入研究和廣泛應(yīng)用暴露了其出乎意料的安全性問題,如Cas9介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(double?strand breakage,DSB)會導(dǎo)致DNA 大片段缺失和染色體易位[15],Cas9 的表達(dá)會激活P53通路[16],Cas9在臨床應(yīng)用中存在潛在的抗原抗體反應(yīng)等[17]。堿基編輯器、先導(dǎo)編輯器、Cas9 活性的精準(zhǔn)調(diào)控等在一定程度上可以解決安全性問題。
DSB 的產(chǎn)生對細(xì)胞來說是非常嚴(yán)重的事件,基于Cas9開發(fā)的堿基編輯器既避免了DSB的產(chǎn)生,又實(shí)現(xiàn)了高效編輯。目前已開發(fā)出兩類堿基編輯器:胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor,CBE)[18]和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor,ABE)[19]。CBE使用胞嘧啶脫氨酶催化胞嘧啶(C)脫氨基產(chǎn)生尿嘧啶(U),在DNA修復(fù)和復(fù)制過程中,U被聚合酶識別為胸腺嘧啶(T),誘導(dǎo)C 到T 的突變;ABE 使用細(xì)菌中人工進(jìn)化而來的腺苷脫氨酶(TadA)催化腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)換成肌苷(I),在復(fù)制和修復(fù)的過程中DNA聚合酶將I識別為G,引入A到G的突變。
最初的CBE 版本BE3 具有序列偏好性和較高的脫靶活性,在目標(biāo)位點(diǎn)會出現(xiàn)一定比例的錯(cuò)誤突變(C 突變成A 或G)。BE4 在BE3 基礎(chǔ)上將尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白(uracil glycosylase inhibitor pro?tein,UGI)增加到兩個(gè),提高了編輯效率,降低了脫靶活性[20]。Thuronyi等[21]利用噬菌體輔助進(jìn)化技術(shù)開發(fā)的evoAPOBEC1?BE4max,可以提高CBE 在GC序列上的編輯效率。當(dāng)目標(biāo)位點(diǎn)附近存在多個(gè)C時(shí)會出現(xiàn)旁觀者脫靶現(xiàn)象,設(shè)計(jì)編輯窗口更窄[22-23]或序列依賴[24]的脫氨酶可以有效降低這種旁觀者脫靶活性。雖然堿基編輯器不會產(chǎn)生DSB,但堿基切除修復(fù)發(fā)生時(shí)仍會有插入/缺失副產(chǎn)物,BE4融合一種噬菌體來源的斷裂末端保護(hù)蛋白Mu Gam可以有效減少CBE 介導(dǎo)的插入/缺失[20]。通過優(yōu)化脫氨酶TadA與nCas9切口酶(D10A)之間的連接序列,可以得到編輯效率更高的ABEmax[25]。Richter等[26]通過噬菌體輔助進(jìn)化進(jìn)一步優(yōu)化了TadA,得到的ABE8e版本極大地提高了A·T到G·C的編輯效率,但也造成了較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。
由于堿基編輯器使用的脫氨酶會與單鏈DNA和RNA結(jié)合,尤其是CBE,會在單鏈DNA和RNA上產(chǎn)生高頻率的脫靶[27-28]。為了減少堿基編輯器的脫靶,Zhou等[29]通過破壞脫氨酶與RNA的結(jié)合能力開發(fā)了3 個(gè)CBE 變異體和1 個(gè)ABE 變異體,極大地提高了堿基編輯器的保真性。
Auzalone等[3]開發(fā)的先導(dǎo)編輯器,可以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)12種點(diǎn)突變和小片段的插入/刪除。先導(dǎo)編輯器包括nCas9切口酶(H840A)和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域,以及3′端攜帶目標(biāo)突變的逆轉(zhuǎn)錄模板和負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(primer binding site,PBS)的pe?gRNA。在pegRNA 引導(dǎo)下,nCas9 切割并釋放非互補(bǔ)鏈,釋放的非互補(bǔ)鏈與pegRNA 3′端PBS 序列互補(bǔ)配對后,逆轉(zhuǎn)錄酶以pegRNA 3′端攜帶的模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,新合成的DNA 通過DNA 修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變或小片段的插入/刪除。與傳統(tǒng)同源重組方法相比,先導(dǎo)編輯器具有更高的編輯效率和更好的靶向靈活性。
2.3.1 抗CRISPR蛋白
隨著天然拮抗劑anti?CRISPR(Acr)蛋白的發(fā)現(xiàn),科學(xué)家開始選擇這些蛋白用于控制Cas9蛋白的活性[30]。Acr 蛋白干擾CRISPR?Cas9 系統(tǒng)的方式主要是與sgRNA競爭性結(jié)合Cas9蛋白,或者直接抑制Cas9 核酸酶活性。已闡明Ⅱ型Acr 蛋白與Cas9 的直接相互作用[31-32],限制了其與DNA 結(jié)合,或阻止了HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域的激活[33]。由于Acr 蛋白具有嚴(yán)格的開關(guān)控制作用,因此可以實(shí)現(xiàn)對Cas 核酸酶的精準(zhǔn)調(diào)控,例如在CRISPR 系統(tǒng)發(fā)揮作用之后轉(zhuǎn)入AcrⅡA4可有效減少脫靶編輯[34]。
2.3.2 光調(diào)控
通過光激活的方式也可以對Cas9活性進(jìn)行精確調(diào)控。光調(diào)控是非入侵性的,可以實(shí)現(xiàn)對Cas9核酸酶活性的可逆控制。Hemphill等[35]使用光鎖定賴氨酸,設(shè)計(jì)出了一種光控Cas9,通過在細(xì)胞中添加進(jìn)化產(chǎn)生的吡咯酰tRNA(PylT)/tRNA合成酶(PCKRS)[36],可以使光鎖定賴氨酸特異性地?fù)饺隒as9 中。這種光控的Cas9 核酸酶在365 nm 光照射120 s 后,其活性可以恢復(fù)到野生型水平。Nihongaki 等[37]報(bào)道了一種光激活Cas9(paCas9),利用一種光誘導(dǎo)二聚化蛋白[38],將Cas9的兩個(gè)片段分別連接磁性蛋白的正負(fù)極,在藍(lán)光照射下,異源二聚體相互配對,重組的pa?Cas9與野生型Cas9活性沒有顯著差異。
此外,Zhang 等[39]報(bào)道了一種通過光控crRNA來調(diào)控CRISPR?Cas9 活性的方法,這一策略將維生素E 與5′不耐光連接子偶聯(lián)合成了一種新的crRNA,維生素E 修飾會抑制Cas9?crRNA/tracrRNA與DNA的結(jié)合,在365 nm紫外光照射下,維生素E和不耐光接頭被去除,恢復(fù)CRISPR?Cas9系統(tǒng)的功能。
2.3.3 小分子抑制劑
Choudhary 實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種高通量篩選平臺[40],鑒定出一種小分子SpCas9 抑制劑BRD0539,對這種抑制劑進(jìn)行優(yōu)化后可以將SpCas9 的活性降低78%。BRD0593調(diào)控Cas9的活性是可逆的,并且對蛋白酶有抵抗力,可在人血漿中穩(wěn)定存在,其對CRISPR?Cas9 進(jìn)行精準(zhǔn)地時(shí)空調(diào)控,具有廣闊的應(yīng)用前景。
CRISPR?Cas9的細(xì)胞毒性在不同細(xì)胞系中有所不同,這種毒性與細(xì)胞中P53 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路相關(guān)。在對人細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Cas9后,攜帶野生型TP53 基因的細(xì)胞系表現(xiàn)出更高的細(xì)胞周期停滯水平[41]。Enache 等[16]發(fā)現(xiàn),在人類癌細(xì)胞系中引入Cas9 會導(dǎo)致p53 通路的上調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ihry等[42]在對人類多能干細(xì)胞進(jìn)行編輯時(shí),Cas9誘導(dǎo)的雙鏈斷裂會讓大多數(shù)細(xì)胞死亡,這種細(xì)胞毒性主要依賴于TP53 激活,所以大大降低了攜帶野生型TP53細(xì)胞的基因編輯效率,也就意味著如果使用經(jīng)過篩選的編輯細(xì)胞用于細(xì)胞治療,這些細(xì)胞TP53突變或者低表達(dá),可能會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。因此在利用基因編輯細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí),監(jiān)測TP53的狀態(tài)尤為重要。除了引起P53效應(yīng),Charlesworth 等[43]對人類血清進(jìn)行免疫印跡檢測時(shí)發(fā)現(xiàn),34例捐贈者中至少一半人的血清中含有SaCas9 和SpCas9 抗體,因此Cas9的免疫原性也增加了臨床使用的風(fēng)險(xiǎn)。另外,體外合成的gRNA也會引發(fā)免疫反應(yīng)[44],對gRNA進(jìn)行修飾可以增加穩(wěn)定性,抑制免疫反應(yīng)[45]。
雖然在Cas9的安全性方面已經(jīng)做了諸多改進(jìn),但一些未知及潛在的安全性問題仍是Cas9 編輯技術(shù)走向臨床應(yīng)用的障礙,因此開發(fā)易調(diào)控Cas9 突變體、抑制TP53 激活的Cas9 突變體、低免疫原性Cas9 突變體等可以為基因治療提供更安全、更有效的工具。
高效的基因編輯取決于將編輯器有效地傳遞到體內(nèi)細(xì)胞和組織中,在體轉(zhuǎn)導(dǎo)對基因編輯來說是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。目前大多數(shù)研究使用腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus,AAV)和慢病毒進(jìn)行在體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因編輯,存在以下問題:①病毒載體的容量有限;②持續(xù)性的表達(dá)會造成脫靶效應(yīng);③遞送載體本身會引發(fā)獨(dú)特的免疫反應(yīng);④潛在的致癌性。
AAV 載體可以攜帶約4.4 kb 的外源DNA,具有多種血清型,對不同組織具有不同的親和性[46-47]。使用分子量更小的SaCas9 或?qū)pCas9/堿基編輯器分成兩部分,再通過內(nèi)含子蛋白剪接系統(tǒng)重組克服了運(yùn)載能力的限制[48-49]。當(dāng)然,從自然界中或者通過蛋白工程,尋找或者開發(fā)更小版本的Cas 蛋白是解決AAV 運(yùn)載限制更好的選擇[50]。AAV 的另一個(gè)缺點(diǎn)是對天然血清型存在先天性體液免疫反應(yīng),這很大程度上限制了其應(yīng)用[51],通過對AAV的衣殼進(jìn)行改造可以減輕這一影響[52]。
慢病毒載體可以容納長達(dá)10 kb的外源DNA[53],并將其半隨機(jī)整合到基因組中。慢病毒可以與不同包膜蛋白進(jìn)行組裝,以靶向不同的細(xì)胞類型[54]。與AAV不同的是,慢病毒攜帶的基因會整合到細(xì)胞基因組中,由此產(chǎn)生的核酸酶長期表達(dá)對細(xì)胞不利。整合酶缺陷慢病毒載體具有瞬時(shí)表達(dá)和更弱的整合能力,可以解決這一問題[55]。最近,有研究開發(fā)了一種類病毒載體,可以直接包裝Cas9 mRNA,使其不會整合到靶細(xì)胞的基因組中,可以在小鼠組織中轉(zhuǎn)導(dǎo)和瞬時(shí)表達(dá)核酸酶[56]。
由于病毒載體存在一些難以避免的缺陷,目前也開發(fā)了一些非病毒傳遞載體[57]。基因編輯器的非病毒載體傳遞效率低于病毒載體,但是它提供了瞬時(shí)核酸酶活性的優(yōu)勢。更重要的是,非病毒載體,如脂質(zhì)納米顆粒、電穿孔技術(shù)等可以重復(fù)多次給藥[58],這也為基因疾病治療提供了更多的可能。
雖然研究者對基因編輯工具的在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行了優(yōu)化,但在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、安全性、靶向性、致癌性等方面還存在諸多問題,亟待開發(fā)安全、高效的在體轉(zhuǎn)導(dǎo)工具和小版本的Cas 蛋白,以盡快打通基因編輯技術(shù)走向臨床治療的“最后一公里”。
從CRISPR?Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在發(fā)展出了多種精準(zhǔn)且多功能的基因編輯工具,在不到8 年的時(shí)間里,基因編輯技術(shù)的發(fā)展為新一代人類基因療法奠定了基礎(chǔ)。盡管基因編輯工具仍存在脫靶和安全風(fēng)險(xiǎn),但其強(qiáng)大的功能和廣泛的適用性,仍然是精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展方向。隨著基因編輯工具的不斷發(fā)展,以及在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式的改進(jìn),將極大地促進(jìn)基因編輯技術(shù)走向臨床應(yīng)用。目前,盡管利用CRIS?PR系統(tǒng)進(jìn)行基因治療已經(jīng)有很大突破,但將這一方法廣泛運(yùn)用到臨床治療中還有一段距離,仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。相信不遠(yuǎn)的未來會開發(fā)出更加安全高效的編輯工具和在體轉(zhuǎn)導(dǎo)體系,用于臨床疾病的治療。