陶興魁，段 紅，張興桃，馮 凡*

(1.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000；2.宿州市天然產(chǎn)物與功能性食品工程技術(shù)研究中心，安徽 宿州 234000)

薄荷醇，又稱(chēng)薄荷腦，是薄荷中的主要成分，一種環(huán)類(lèi)單萜化合物，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域[1]。近年來(lái)，關(guān)于薄荷醇對(duì)各種癌癥細(xì)胞的抗癌作用的基礎(chǔ)研究取得了一些進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，薄荷醇對(duì)前列腺癌、結(jié)腸癌等多腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[2-5]，其主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的周期阻滯、凋亡及信號(hào)調(diào)控等方式抑制癌細(xì)胞增殖[6]。苗延青等[7]研究薄荷醇在適宜的濃度時(shí)，對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用明顯，抑制率為26.73%～42.53%。薄荷醇可激活DU145細(xì)胞中的TRPM8通道，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中Ca2+熒光強(qiáng)度，從而起到抑制細(xì)胞增殖的作用[8]。

目前，其他藥物單體在抗肺癌細(xì)胞作用及相關(guān)機(jī)制等方面已有比較多的研究。羅林明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，百合總皂苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲具有抑制作用，可通過(guò)下調(diào)PCNA的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞DNA合成，通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。顏曉靜等[10]研究丹參-人參組分配伍能夠抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡和降低細(xì)胞骨架的面積，且抑制效果呈劑量依賴(lài)性。但目前關(guān)于薄荷醇在抗肺癌機(jī)制方面的研究報(bào)道較少，對(duì)于其通過(guò)自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡機(jī)制方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以人肺癌SK-LU-1細(xì)胞為體外研究材料，將不同濃度的薄荷醇作用于肺癌SK-LU-1細(xì)胞，分析細(xì)胞增殖、凋亡及遷移特性，并檢測(cè)自噬信號(hào)通路LC-3 Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、Atg12蛋白表達(dá)，以期為薄荷醇通過(guò)細(xì)胞自噬促進(jìn)肺癌SK-LU-1細(xì)胞的凋亡機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人肺癌SK-LU-1細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑與藥物 薄荷醇(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10458801，純度≥99.5%)。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)11965)；BI胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)10270106)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)07302020)；5-乙炔基-2′-脫氧尿嘧啶核苷(EdU)試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司，批號(hào)R1127)；LC-3 Ⅰ/Ⅱ、Atg12、Beclin-1、GAPDH抗體(英國(guó)Biorbyt公司，批號(hào)orb33328、orb33381、orb380530、orb555879)；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)4223-T、5023-T、14220-T、9502-T)，保存于宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)M9281)；二抗抗體(美國(guó)Bioworld公司，批號(hào)BS13278)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司，批號(hào)353090)。其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 IX71倒置熒光顯微鏡、CX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Infinite 200 PRO型多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；電子天平(萬(wàn)分之一，美國(guó)奧豪斯公司)；超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃水浴加熱解凍SK-LU-1細(xì)胞，接種于DMEM培養(yǎng)基(含12%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素)中，PBS洗滌后胰酶消化，置于5%CO2，37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，共培養(yǎng)3～4代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)薄荷醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響 待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度達(dá)到80%以上后將其消化，制成細(xì)胞懸液，設(shè)置對(duì)照組(不加薄荷醇)和給藥組(薄荷醇濃度25、50、100、200、400 μmol/L)，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL細(xì)胞懸液(0.6×105/mL)接種于96孔板中[11]，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液(純CCK-8∶純培養(yǎng)基=1∶9)，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h左右，將處理好的培養(yǎng)板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A)，生長(zhǎng)抑制率=(1-A給藥組/A對(duì)照組)×100%。

2.3 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)檢測(cè)方法檢測(cè)薄荷醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響 以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄細(xì)胞板舊培養(yǎng)液，給藥組加入含薄荷醇50、100 μmol/L的完全培養(yǎng)液，另外設(shè)置對(duì)照組(不加薄荷醇)，平行6個(gè)復(fù)孔，加入250 μL溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后參照EdU試劑盒步驟進(jìn)行EdU標(biāo)記細(xì)胞、固定促滲、檢測(cè)及DNA復(fù)染等操作[12]，最后將培養(yǎng)板置于IX71倒置熒光顯微鏡下，隨機(jī)選擇拍攝熒光圖像，采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4 Transwell法檢測(cè)薄荷醇對(duì)細(xì)胞遷移的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PET膜鋪板，每小室加入200 μL細(xì)胞懸液，鋪板時(shí)細(xì)胞數(shù)量為2.6×104個(gè)/孔放入每孔提前加好500 μL 20% DMEM的下室中，37 ℃放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，次日觀察。進(jìn)行薄荷醇培養(yǎng)操作，設(shè)置對(duì)照組(不加薄荷醇)和給藥組(加入含薄荷醇50、100 μmol/L的完全培養(yǎng)液)，每組3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)上室加入200 μL溶液，下室加入500 μL溶液，孵育48 h后室溫固定30 min，染色30 min，棉簽蘸水后吸干，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)拍攝圖像，觀察細(xì)胞形態(tài)[13]，采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5 Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度1.0×105/mL的懸浮液接種于培養(yǎng)板上，每組4個(gè)復(fù)孔，隨機(jī)分為對(duì)照組(不加薄荷醇)、薄荷醇組(100 μmol/L)，在培養(yǎng)箱中孵育48 h后取出，1 000 r/min離心，棄去上清液，根據(jù)Annexin V/PI試劑盒說(shuō)明，用PBS洗細(xì)胞2～3次，不含EDTA的胰蛋白酶消化，再用4%PBS洗細(xì)胞2次，收集細(xì)胞進(jìn)行重懸，加入5 μL AnnexinV/PI，室溫避光染色10～15 min，加入2.5 μL PI試劑后，30 min內(nèi)完成細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

2.6 Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞飽和度達(dá)到80%以上時(shí)分為對(duì)照組(不加薄荷醇)、薄荷醇組(100 μmol/L)、抑制劑組(自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤)、薄荷醇+抑制劑組(薄荷醇100 μmol/L+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤)，培養(yǎng)48 h，離心分離收集細(xì)胞，PBS漂洗2次，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，收集細(xì)胞總蛋白。取蛋白樣品25 μg上樣，SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，加入LC-3 Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、Atg12蛋白(1∶1 000)、GAPDH(1∶8 000)抗體，4 ℃孵育12 h，PBS漂洗3次，加入二抗(1∶10 000)，室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜2次，ECL顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件分析灰度，計(jì)算LC-3 Ⅰ/Ⅱ，Beclin-1、Atg12蛋白相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞增殖的影響 圖1顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度薄荷醇處理48 h后抑制率升高，并呈濃度依賴(lài)性，IC50為97.94 μmol/L，故選擇50、100 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。圖2顯示，50 μmol/L薄荷醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響不明顯，而在100 μmol/L下具有抑制作用(P<0.01)。

圖1 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞增殖的抑制率

注：A為染色成像圖(EdU，×200)，B為陽(yáng)性細(xì)胞百分率柱狀圖與對(duì)照組比較，**P<0.01。圖2 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞增殖的影響

3.2 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞遷移能力的影響 圖3顯示，PET膜上遷移的細(xì)胞數(shù)目在薄荷醇濃度為50 μmol/L時(shí)減少不明顯，而在100 μmol/L下可抑制細(xì)胞遷移侵襲，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與“3.1”項(xiàng)下結(jié)果基本一致。

注：A為染色成像圖(結(jié)晶紫染色，×200)，B為陽(yáng)性細(xì)胞遷移數(shù)柱狀圖與對(duì)照組比較，**P<0.01。圖3 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞遷移的影響

3.3 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞凋亡的影響 圖4顯示，對(duì)照組和給藥組(50、100 μmol/L)細(xì)胞早期凋亡率分別為(0.53±0.12)%、(3.83±1.20)%、(21.83±1.87)%，中期凋亡率分別為(0.07%±0.03)%、(2.79±0.78)%、(4.79±1.40)%，晚期凋亡率分別為(0.20±0.05)%、(1.31±0.62)%、(1.30±0.57)%，表明100 μmol/L薄荷醇能促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.01)。圖5顯示，100 μmol/L薄荷醇處理后Bcl-2表達(dá)降低，Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)升高。

圖4 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞凋亡的影響

注：A為蛋白免疫印跡圖，B為蛋白條帶灰度值掃描柱狀圖與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖5 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞凋亡通路蛋白表達(dá)的影響

3.4 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞自噬信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白的影響 圖6顯示，與對(duì)照組比較，給藥組SK-LU-1細(xì)胞自噬信號(hào)通路蛋白LC-3 Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1、Atg12表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；雖然抑制劑組(自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤)抑制了自噬信號(hào)通路蛋白表達(dá)(P<0.05)，但薄荷醇+抑制劑組(100 μmol/L薄荷醇+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤)有所提高(P<0.01)。

注：A為蛋白免疫印跡圖，B為蛋白條帶灰度值掃描柱狀圖與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 薄荷醇對(duì)SK-LU-1細(xì)胞自噬通路蛋白表達(dá)的影響

4 討論

薄荷醇在抑制多種腫瘤細(xì)胞的的增殖方面已有大量研究，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的可能機(jī)制也已有不少報(bào)道。研究薄荷醇對(duì)小鼠皮膚癌變的預(yù)防潛力中發(fā)現(xiàn)，薄荷醇能明顯抑制皮膚癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，顯著降低腫瘤發(fā)生率[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，薄荷醇通過(guò)TRPM8非依賴(lài)性途徑抵抗多種人類(lèi)的癌癥細(xì)胞增殖擴(kuò)散。薄荷醇通過(guò)獨(dú)立于TRPM8的Ca2+流入機(jī)制，促使Ca2+在PC-3細(xì)胞中增加，在高濃度薄荷醇作用下可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[14]。研究薄荷醇對(duì)PC-3前列腺癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，薄荷醇誘導(dǎo)G2/M阻滯，特別是顯著下調(diào)了G2/M期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子PLK1，并抑制了其下游信號(hào)通路[15]。還有研究表明薄荷醇可以通過(guò)TRPM8通道誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞線(xiàn)粒體膜去極化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。

本研究通過(guò)CCK-8法和EdU法研究薄荷醇對(duì)肺癌SK-LU-1細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明薄荷醇對(duì)肺癌SK-LU-1細(xì)胞增殖有抑制作用。當(dāng)薄荷醇濃度為100 μmol/L，肺癌SK-LU-1細(xì)胞在作用48 h后抑制作用顯著(P<0.01)；分析Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，薄荷醇對(duì)肺癌SK-LU-1細(xì)胞遷移作用在100 μmol/L時(shí)抑制效果明顯(P<0.01)，綜合該部分薄荷醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)薄荷醇濃度為100 μmol/L時(shí)，肺癌SK-LU-1細(xì)胞增殖和遷移抑制作用顯著。

本研究選用肺癌SK-LU-1細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)薄荷醇對(duì)肺癌SK-LU-1細(xì)胞凋亡的影響，并且免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)薄荷醇對(duì)細(xì)胞凋亡通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明薄荷醇能夠通過(guò)降低凋亡通路蛋白Bcl-2的表達(dá)以及提高Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，同時(shí)提高自噬信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白LC-3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg12的表達(dá)。目前的研究顯示Atg5和Atg12為自噬小體形成的“核心”，是啟動(dòng)自噬小泡形成的重要蛋白質(zhì)，在癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。Atg5可以被Caplains剪切，導(dǎo)致Atg5 N端片段以一種特定未知的機(jī)制轉(zhuǎn)移，在線(xiàn)粒體上與抗凋亡蛋白Bcl-xL結(jié)合，促使線(xiàn)粒體細(xì)胞大量釋放C色素，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。研究發(fā)現(xiàn)在不同凋亡因子刺激下，Atg12不但是caspase激活所必需蛋白，它還可通過(guò)不同途徑結(jié)合Bcl-2、Mcl-1表現(xiàn)促凋亡能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Atg12是因?yàn)榫邆浜虰cl-2、Mcl-1結(jié)合的BH3結(jié)構(gòu)域而具有促使細(xì)胞凋亡功能[18]。而薄荷醇對(duì)肺癌SK-LU-1細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用，且能夠提高Atg12蛋白表達(dá)，同時(shí)能夠促進(jìn)形成自噬小體關(guān)鍵囊泡蛋白LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表達(dá)，說(shuō)明薄荷醇能夠活化肺癌細(xì)胞的自噬信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。該結(jié)果為薄荷醇抗肺癌研究及其分子機(jī)制研究提供了新思路，為薄荷醇在治療肺癌上提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。