曹乃馨，羅陽(yáng)蘭，解修超*，閻 勇，鄧百萬(wàn)

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007)

夾竹桃NeriumindicumMill.是夾竹桃科夾竹桃屬常綠直立大灌木，其葉、皮、根、莖、花中含有強(qiáng)心苷類、甾體類、萜類、香豆素類、黃酮苷類等多種活性化合物，具有滅螺、殺蟲和化感作用，還具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、強(qiáng)心的功效，但易引起中毒[1-8]。目前對(duì)夾竹桃的研究主要集中于強(qiáng)心苷、生物堿類、多糖等化學(xué)成分、藥理活性及藥物開發(fā)、生物防治及環(huán)境修復(fù)等方面[9-10]。

李昌靈等[11]研究了夾竹桃葉不同提取液的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)醇提取液的抑菌效果最好，水提取液較弱，醚提取液最弱。董道青等[12]研究了夾竹桃葉五種有機(jī)試劑提取物對(duì)福壽螺的毒殺作用，發(fā)現(xiàn)正己烷提取物的毒殺活性最高，甲醇提取物的毒殺活性最低。研究發(fā)現(xiàn)夾竹桃葉具有一定的生物活性，但對(duì)夾竹桃花的研究鮮見報(bào)道，為明確夾竹桃花的生物活性以及不同溶劑提取物的效果，本研究以石油醚、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和乙酸乙酯四種有機(jī)試劑為溶劑，用索氏提取法提取夾竹桃花的化學(xué)物質(zhì)，通過GC-MS進(jìn)行組分分析，并比較其抗氧化和抑菌活性，旨在篩選出高活性、低成本的提取溶劑，探索夾竹桃花的潛在藥用價(jià)值，為夾竹桃花的深入研究和綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 N100O型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(tái)(上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司)；YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；Epoch2微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)BioTek公司)。

1.2 材料 夾竹桃花采自陜西省漢中市城固縣(北緯N33°09′24″，東經(jīng)E107°20′00″)，40 ℃恒溫干燥至恒重，粉碎過40目篩保存于陰暗處備用。碧云天總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP法)?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis，批號(hào)CMCC63501)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，批號(hào)CMCC26003)；大腸桿菌(Escherichiacoli，批號(hào)CMCC44102)；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，批號(hào)CMCC10104)；白色念珠菌(Candidaalbicans，批號(hào)CMCC98001)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備 稱取藥材粉末10 g(M)，以石油醚(60～90 ℃)、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯為溶劑，索氏提取3 h，合并提取液，減壓濃縮得到提取物，在40 ℃下干燥至恒重后，稱定質(zhì)量(m)，計(jì)算得率，公式為得率=(m/M)×100%。結(jié)果，提取物得率分別為7.19%、5.97%、5.96%、4.33%，均有夾竹桃花芳香，其中石油醚提取物為深綠黏稠物質(zhì)，二氯甲烷提取物為深綠固體物質(zhì)，無(wú)水乙醇提取物為棕綠色固體物質(zhì)，乙酸乙酯提取物為淺綠固體物質(zhì)。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 供試品溶液制備 用正己烷配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的提取物溶液，量取10 mL于圓底燒瓶中，加1 mol/L KOH-CH3OH溶液2 mL，40 ℃振蕩30 min，靜置15 min后70 ℃水浴蒸干，加5% H2SO4-CH3OH溶液4 mL，70 ℃振蕩60 min，加正己烷5 mL，充分振蕩后靜置1 h，取上清液4 mL，無(wú)水硫酸鈉干燥后取上清液2 mL，正己烷定容至10 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得[13]。

2.2.2 色譜條件 7890A-5975C型毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；程序升溫(初始溫度50 ℃，保持2 min，3 ℃/min升至180 ℃，保持4 min，5 ℃/min升至210 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至280 ℃，保持15 min)；載氣氦氣(99.999%)，體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃；分流進(jìn)樣，分流比20∶1。

2.2.3 質(zhì)譜條件 EI離子源70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲時(shí)間3 min；全掃描采集模式，質(zhì)量范圍m/z45～550。

2.2.4 成分分析 利用Nist17 s.Lib標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)和文獻(xiàn)解析，結(jié)合保留時(shí)間確認(rèn)化學(xué)成分，按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見圖1、表1。由此可知，石油醚(A)、二氯甲烷(B)、無(wú)水乙醇(C)、乙酸乙酯提取物(D)中分別有30、58、52、62個(gè)化合物，共有成分是正十九烷、十七烷、癸酸甲酯、10-甲基十九烷、正二十七烷、正二十八烷、3-羥基十六烷酸甲酯、十四酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、山崳酸甲酯、β-香樹脂醇、α-香樹脂醇，分別占比69.17%、69.44%、64.11%、62.75%。

圖1 提取物GC-MS圖

表1 提取物成分GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 還原能力 以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見圖2。由此可知，4種溶劑提取物均有一定還原能力，依次為無(wú)水乙醇提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>乙酸乙酯提取物；在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，四者還原能力分別為3.41、1.08、1.04、0.88 mmol/L。

圖2 4種溶劑提取物的還原能力

2.3.2 DPPH自由基清除能力 以Trolox作陽(yáng)性對(duì)照，參考王寒等[14]報(bào)道的方法測(cè)定，結(jié)果見圖3。由此可知，4種溶劑提取物對(duì)DPPH自由基均有一定清除作用，并隨著其質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，依次為無(wú)水乙醇提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>乙酸乙酯提取物。

圖3 提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3.3 羥自由基清除能力的測(cè)定 以Trolox作陽(yáng)性對(duì)照，參考羅陽(yáng)蘭等[15]報(bào)道的方法測(cè)定，結(jié)果見圖4。由此可知，4種溶劑提取物對(duì)羥自由基均有一定清除作用，其中石油醚提取物隨其質(zhì)量濃度升高而明顯增強(qiáng)，乙酸乙酯提取物較趨于平緩，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，四者對(duì)羥自由基的清除率分別為51.22%、42.16%、50.82%、48.24%。

圖4 提取物對(duì)羥自由基的清除能力

2.4 抑菌活性研究 將靶標(biāo)菌活化后，調(diào)制菌液濃度為1.0×106～1.0×107CFU/mL，采用濾紙片擴(kuò)散法[16]考察抑菌活性，二倍連續(xù)梯度稀釋法[17]測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)，平板轉(zhuǎn)種法測(cè)定最小殺菌濃度(MBC)，結(jié)果見圖5、表2～3。由此可知，陰性對(duì)照組無(wú)抑菌圈，表明20% DMSO對(duì)靶標(biāo)菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用；含0.5%碘伏溶液的陽(yáng)性對(duì)照組抑菌圈直徑均大于15 mm，表明實(shí)驗(yàn)方法可行；質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，4種溶劑提取物周圍均有抑菌圈，表明均具有一定抑菌活性；石油醚提取物對(duì)E.coli抑菌效果最好，而二氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯提取物對(duì)B.subtilis抑菌效果最好。

表2 提取物對(duì)靶標(biāo)菌的抑菌圈直徑

3 討論

本研究通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)夾竹桃花石油醚、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和乙酸乙酯提取物中分別有30、58、52、62種化合物，四種溶劑提取物的13種共有成分分別占對(duì)應(yīng)提取物的69.17%、69.44%、64.11%、62.75%。由此可見，不同溶劑之間提取物成分的種類及含量均有差異，主要是因?yàn)槿軇O性等性質(zhì)的差異[18]。

注：1為石油醚提取物，2為二氯甲烷提取物，3為無(wú)水乙醇提取物，4為乙酸乙酯提取物，5為陽(yáng)性對(duì)照，6為陰性對(duì)照。圖5 提取物對(duì)靶標(biāo)菌的抑菌圈

表3 提取物抑菌活性測(cè)定結(jié)果

夾竹桃花二氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯提取物成分的研究鮮有報(bào)道，針對(duì)石油醚提取物與劉語(yǔ)等[19]的報(bào)道對(duì)比發(fā)現(xiàn)共有7種相同的物質(zhì)，分別是癸醛、2,6,10-三甲基十二烷、十二醛、十四醛、十六醛、十五烷和十七烷，化合物及含量的差異可能與夾竹桃品種、甲酯化方法和儀器設(shè)備等有關(guān)。

由于四種溶劑提取物組分較為復(fù)雜，本研究?jī)H進(jìn)行成分的分析鑒定。其中，α-香樹脂醇和β-香樹脂醇是同分異構(gòu)體，屬于三萜類化合物，具有抑制脂肪細(xì)胞分化的作用，可作為新的治療和預(yù)防肥胖的藥物[20]。十四酸、十六酸等高級(jí)飽和脂肪酸，是自然界中分布最廣的脂肪酸之一，幾乎所有的油脂中都含有數(shù)量不等的軟脂酸組分，十六酸具有抗腫瘤和抗衰老等活性[21]。癸酸等中鏈脂肪酸具有抑菌活性，癸酸具有較高的酸度系數(shù)，可以穿透細(xì)菌細(xì)胞壁、磷脂分子層和細(xì)胞膜[22]。亞油酸是人體自身不能合成但必需的功能性多不飽和脂肪酸代表物質(zhì)之一，具有抗癌、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、降低血脂血壓、軟化血管、防止動(dòng)脈粥樣硬化及預(yù)防脂肪肝、抑制血栓形成的功效[23]。

抗氧化和抑菌結(jié)果顯示，四種溶劑提取物均有一定的生物活性，這可能與提取物中化學(xué)成分及含量有關(guān)。無(wú)水乙醇提取物的生物活性最好，GC-MS分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)含量較高的成分依次為α-香樹脂醇(32.44%)、棕櫚酸甲酯(17.33%)、亞油酸甲酯(10.01%)、油酸甲酯(8.2%)、γ-硫辛酸(5.07%)、硬脂酸甲酯(4.37%)、β-香樹脂醇(3.3%)、癸酸甲酯(2.28%)。石油醚提取物的活性次之，相對(duì)含量較高的成分依次為α-香樹脂醇(41.43%)、棕櫚酸甲酯(12.13%)、十四醛(7.39%)、β-香樹脂醇(7.23%)、8,11-十八二烯酸甲酯(3.79%)。結(jié)合提取物的得率，石油醚和無(wú)水乙醇是提取夾竹桃花活性成分比較理想的有機(jī)溶劑，可為新型抗氧化劑、新藥等開發(fā)提供理論參考，為夾竹桃花的資源開發(fā)提供依據(jù)。