劉葉倩，李 弘，龔 姍，歐陽榮，任衛(wèi)瓊，龍紅萍

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

吳茱萸來源于蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth、石虎EuodiaRutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸EuodiaRutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實，主要功效為溫中散寒、降逆止痛[1]?！秱浼鼻Ы鹨健贰皡擒镙侨齼?以清酒三升漬一宿，煮如蟻鼻沸……治產后腹中痛疾病”，且其酒制品用于鎮(zhèn)痛效果顯著[2]，但其活性成分缺乏系統的研究。

液質聯用技術(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)能快速、精確地鑒定分析所獲得的質譜信息，在鑒別化合物方面具有明顯的優(yōu)勢，是定性定量分析中藥的重要手段[3-4]。故本實驗以痛經小鼠為研究對象，觀察吳茱萸生品和酒制品的鎮(zhèn)痛作用，同時采用UPLC-Q-TOF-MS對吳茱萸的水提液進行系統的定性定量分析，對比酒制前后吳茱萸化學成分及含量變化，以期為吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛活性物質的研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級KM小鼠70只，雌性，體質量18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物合格證號43004700051990，實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2016-0002。

1.2 試劑與藥材 吳茱萸堿(批號110802-200606)、吳茱萸次堿(批號110801-201006)、蘆丁(批號0080-9705)對照品(中國食品藥品檢定研究院)；檸檬苦素(批號1180-71-8，成都瑞芬思生物科技有限公司)；去氫吳茱萸堿(批號67909-49-3，河北晨光生物科技集團股份有限公司)。苯甲酸雌二醇注射液(批號B180601，寧波三生生物科技有限公司)；縮宮素注射液(批號H34022979，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司)；羅通定片(批號H14020787，山西云鵬制藥有限公司)；ELISA試劑盒PGE2、ET-1、NO(批號20190702，上海晶天生物科技有限公司)。吳茱萸生品(湖南)、酒制品(湖南)均購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經該院張裕民主任藥師鑒定為蕓香科疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實。甲醇、乙腈(質譜純，德國Merck Millipore公司)；甲酸銨(質譜純，美國Fisher公司)；蒸餾水(深圳屈臣氏蒸餾水有限公司)。

1.3 儀器 Agilent 1290UPlC-6540 Q-TOF-MS儀，配置MassHunter質譜工作站和Mass analysis質譜數據處理系統、Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取(MFE)功能、TCM-DATA中藥成分數據庫、Agilent ZORBAX EcliPse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)(美國Agilent公司)；S-23高速臺式離心機(湖南湘儀科教儀器有限公司)；AUW120D電子分析天平(日本Shimadzu公司)；MK3型酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]。

2 方法

2.1 藥液制備

2.1.1 水提物制備 取吳茱萸生品與酒制品各270 g于煎藥器中，分別加入10倍量蒸餾水浸泡30 min，武火加熱至沸騰后轉文火煎煮1 h，濾過，濾渣再加入8倍量蒸餾水，重復1次，40 min后過濾，合并2次濾液，采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，真空干燥，得到吳茱萸生品、酒制品干膏各74.57 g，每1 g干膏相當于3.62 g中藥[5]。

2.1.2 受試藥物制備 取吳茱萸生品、酒制品干膏各3.6 g，蒸餾水溶解稀釋，高、低生藥質量濃度均分別為0.195、0.065 g/mL，即得。取羅通定片78片，碾碎成粉末，加蒸餾水，充分混勻，配制成質量濃度為0.47 g/mL的混懸液，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

2.2.1 對照品、供試品溶液制備

2.2.1.1 供試品溶液 取3 g干膏置50 mL錐形瓶中，加入30 mL 70%甲醇，超聲處理30 min，冷卻，70%甲醇補充至超聲前質量，離心，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.1.2 對照品溶液 分別精密稱取5 mg蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，分別吸取0.1 mL于進樣瓶中，即得。

2.2.2 分析條件

2.2.2.1 色譜 Agilent ZORBAX EcliPse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相乙腈(A)-0.05 mmol/L甲酸銨(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～35% A；10～20 min，35%～65% A；20～30 min，65%～5% A)；體積流量0.4 mL/min；溫度25 ℃；進樣量1 μL。

2.2.2.2 質譜 電噴霧離子化(ESI)，正離子分析模式檢測；采用Agilent標準調諧液ESI-l low Concentration Tuning Mix G1969-85000對進樣分析前的準確質量數進行校正。一級質譜質量掃描范圍m/z100～1 700；脫溶劑氣體N2體積流量6.8 L/min；脫溶劑氣溫度325 ℃；鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓4.0 kV；Fragment電壓150 V。二級質譜質量掃描范圍m/z50～1 000；二級Fragment電壓10、20、40 V。

2.3 鎮(zhèn)痛實驗

2.3.1 分組及建模 70只小鼠按照體質量隨機分為7組，每組10只，分別為正常組，模型組，吳茱萸生品低、高劑量組，吳茱萸酒制品低、高劑量組，羅通定組，除正常組外，其余各組小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇10 d，每天1次，第1、10天注射劑量為10 mg/kg，第2～9天注射劑量為5 mg/kg。

2.3.2 給藥 根據文獻[6]報道，吳茱萸人日用量為10 g，換算得到小鼠劑量為1.3 g/kg，以臨床用量為依據，設定吳茱萸生品、酒制品高、低生藥劑量均分別為3.9、1.3 g/kg。從造模第5天開始，吳茱萸生品、酒制品高、低劑量組按照20 mL/kg灌胃體積分別予以0.195、0.065 g/mL受試藥物，羅通定組等劑量灌胃0.47 mg/mL混懸液，正常組、模型組灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)5 d，每天1次。

2.3.3 扭體反應考察 在末次給藥前24 h注射最后1次苯甲酸雌二醇，給藥后40 min按照10 U/kg劑量腹腔注射縮宮素，迅速觀察小鼠第1次出現扭體反應的時間，作為扭體潛伏期，并記錄30 min內扭體反應發(fā)生的次數[7]。

2.3.4 血清指標檢測 實驗結束后小鼠眼球取血，4 500 r/min離心10 min，取其上清液，按照說明書相關操作方法，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清的前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)、內皮素-1(endothelin 1，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)水平。

3 結果

3.1 鎮(zhèn)痛實驗

3.1.1 小鼠扭體次數比 與正常組比較，模型組小鼠扭體次數增多(P<0.01)，提示模型制備成功；與模型組比較，吳茱萸酒制品高劑量組小鼠扭體次數減少(P<0.01)，酒制品低劑量組、生品高低劑量組小鼠扭體次數有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與同劑量生品組比較，吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠扭體次數減少，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

注：與正常組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖1 吳茱萸對小鼠扭體次數的影響

3.1.2 小鼠扭體潛伏期 與正常組比較，模型組小鼠扭體潛伏期縮短(P<0.01)，提示模型制備成功；與模型組比較，吳茱萸生品、酒制品低、高劑量組小鼠扭體潛伏期延長(P<0.01)；與同劑量生品組比較，吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠扭體潛伏期延長(P<0.05)，見圖2。

注：與正常組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與同劑量生品組比較，#P<0.05。圖2 吳茱萸對小鼠扭體潛伏期的影響

3.1.3 小鼠血清PEG2、ET-1、NO水平 與正常組比較，模型組小鼠血清ET-1水平升高，PEG2、NO水平降低(P<0.01)；與模型組比較，吳茱萸生品高、低劑量組小鼠血清PGE2、NO水平升高，ET-1水平降低，但差異無統計學意義(P>0.05),吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠血清PEG2、NO水平升高，ET-1水平降低(P<0.05，P<0.01)；與同劑量生品組比較，吳茱萸酒制品高、低劑量組小鼠血清PGE2水平升高(P<0.01)，NO水平有所升高，ET-1水平有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

注：與正常組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01；與同劑量生品組比較，##P<0.01。圖3 吳茱萸對小鼠血清PGE2、ET-1、NO水平的影響

3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析 圖4～5顯示，從吳茱萸生品、酒制品中鑒定出24個化合物，其中前者20個，后者24個，見表1。

表1 吳茱萸生品、酒制品所含成分質譜信息

圖4 供試品正離子流色譜圖

吳茱萸酒制后，其主要鎮(zhèn)痛成分蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量發(fā)生明顯變化，并明顯高于生品，見表2。

表2 吳茱萸酒制前后主要鎮(zhèn)痛成分含量變化

4 討論

吳茱萸史載于《神農本草經》，列為中品，其言“主溫中下氣止痛”，具有散寒止痛之功[1]。吳茱萸能通過減緩縮宮素引起的子宮平滑肌收縮頻率及收縮力度，起到緩解痛經的作用[8]。酒能入血分，主行藥勢，能增強吳茱萸溫熱之性、散寒止痛之功[9]。痛經患者以寒證為主，針對寒證痛經患者，溫經散寒為其治療之根本[10]。但吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛效果與有效成分之間的相關性鮮有報道。LC-MS是液相色譜和質譜技術的結合體，既有前處理簡便，化合物信息豐富等優(yōu)點，同時可結合質譜裂解規(guī)律，用于中藥未知成分解析，是目前中藥化學成分鑒定分析的重要手段[11]。因此，本實驗選用痛經小鼠模型考察其鎮(zhèn)痛作用，并運用UPLC-Q-TOF-MS技術比較吳茱萸酒制前后有效成分的變化，以期為吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛活性物質的研究提供實驗依據。初步闡明吳茱萸鎮(zhèn)痛的物質基礎。

1.蘆丁 2.去氫吳茱萸堿 3.檸檬苦素 4.吳茱萸堿 5.吳茱萸次堿圖5 對照品正離子流色譜圖

痛經的發(fā)病機理與月經期PGE2、ET-1、NO、OT的變化有關。前列腺素(prostaglandin，PG)作為重要的炎性物質，月經期間PGE2水平降低，使得子宮內膜細胞破壞，釋放大量的前列腺素E2α(prostaglandin E2ɑ，PGE2ɑ)，引起子宮平滑肌強烈收縮，從而導致痛經[12-14]。ET-1和NO是子宮內膜中作用相反的兩種血管活性物質，ET-1水平的增高使血管強烈收縮，產生疼痛[15]；NO則表現出對痛經的雙向調節(jié)作用，含量升高時可抑制子宮收縮，緩解疼痛；降低可引起子宮強烈收縮，加重痛經癥狀[16-17]。本實驗發(fā)現，痛經模型組小鼠扭體次數增加，潛伏期縮短，PGE2、NO水平降低，ET-1水平升高，提示造模成功。經吳茱萸干預后，給藥組小鼠扭體次數減少、潛伏期延長，PGE2、NO水平升高，ET-1水平降低，其中酒制品高劑量組效果顯著(P<0.01)。提示酒制后吳茱萸鎮(zhèn)痛療效增加。

借助UPLC-Q-TOF-MS技術，在吳茱萸水提物化學成分中共鑒別出24種化合物，其中吳茱萸生品20種，吳茱萸酒制品24種。吳茱萸酒制后山柰酚-3-鼠李糖基葡萄糖苷-7-葡萄糖苷、蘆丁、Evollionines A、吳茱萸酰胺成分增加。其中蘆丁的鎮(zhèn)痛活性早有報道[18]。Carvalho等[19]提出蘆丁可通過下調粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)的表達，減輕炎癥反應，起到緩解疼痛的目的。且在糖尿病大鼠中發(fā)現，蘆丁可通過抑制福爾馬林試驗反應，逆轉糖尿病大鼠的化學痛覺過敏和認知障礙[20]。已有研究報道蘆丁、吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸次堿及去氫吳茱萸堿等成分具有鎮(zhèn)痛作用[21]。本實驗對吳茱萸酒制前后主要鎮(zhèn)痛成分蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿以及吳茱萸次堿的含量進行了比較，發(fā)現酒制后五種鎮(zhèn)痛成分含量均有不同程度增加，以蘆丁、吳茱萸堿和檸檬苦素的含量變化最為明顯，提示吳茱萸酒制后鎮(zhèn)痛作用的增強可能與蘆丁、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿以及吳茱萸次堿五種鎮(zhèn)痛成分含量的增加有關。

綜上，吳茱萸酒制前后鎮(zhèn)痛活性與其有效成分及含量變化發(fā)生一定程度的改變有關，為吳茱萸酒制前后藥效物質基礎研究提供實驗依據；但其酒制前后成分及含量變化及其原因，以及這些成分對痛經小鼠鎮(zhèn)痛的具體作用機制有待進一步研究。