尚 曉，曾瑚瑚，陳 燁，王 英，黃曉君，范春林，葉文才

(暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與創(chuàng)新藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510632)

肚痛丸由干姜、豆蔻(去殼)、肉桂、枳實(麩炒)、木香、烏藥、厚樸(姜制)、砂仁、蓽茇、罌粟殼10味藥材組成，具有溫中散寒，理氣止痛的功效，臨床上主要用于寒凝氣滯所致的腹中冷痛、胸脅脹悶、嘔逆吐酸等癥，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(中藥成方制劑第六冊)，但僅有外觀、性狀、水分、重量差異等丸劑項下常規(guī)檢查項目[1]，僅文獻[2]采用GC法同時測定其中6種成分的含量。因此，本實驗建立肚痛丸UPLC指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)進行綜合分析，以期為該制劑穩(wěn)定性評價及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)[3-11]。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀[沃特世科技(上海)有限公司]；Agilent 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF高分辨四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)，配置標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)、MassHunter Acuquisition色譜工作站、Qualitative Analysis數(shù)據(jù)處理軟件；BX8200HP型超聲儀(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；EX225DZH型電子天平[0.01 mg，奧豪斯儀器(常州)有限公司。色譜純甲醇、乙腈(山東禹王和天下新材料有限公司)；質(zhì)譜純甲醇、乙腈(德國Merck公司)；質(zhì)譜純甲酸[阿拉丁試劑(上海)有限公司]；水為Milli-Q超純水(美國Millipore公司)。

橙皮苷(批號wkq19013105)、香蜂草苷(批號wkq19010204)、胡椒堿(批號wkq18050704)、和厚樸酚(批號wkq19022708)、厚樸酚(批號wkq19022605)對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司；蕓香柚皮苷(批號181009)對照品購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%。40批肚痛丸來源于廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～3 min，5%～35%B；3～12 min，35%～53%B；12～13 min，53%～65%B；13～24 min，65%～80%B；24～27 min，80%～95%B；27～35 min，95%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm；進樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，正、負離子模式，掃描范圍m/z100～1 500；干燥器體積流量8.0 L/min，溫度325 ℃；霧化器壓力35 psi(1 psi=0.133 kPa)；錐孔電壓75 V；毛細管電壓4 000 V(+)、3 500 V(-)。數(shù)據(jù)處理工作站采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06.00。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、胡椒堿、和厚樸酚、厚樸酚對照品各約10 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得貯備液(1 mg/mL)，取1 mL置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含100 μg該成分)。

2.2.2 供試品溶液 取丸劑適量，研細，取粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(100 Hz)處理60 min，冷卻至常溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液適量，置于2 mL離心管中，離心(13 000 r/min)20 min，即得。

2.3 參照峰確定 由于6號峰(厚樸酚)與其他色譜峰分離度良好，保留時間、峰面積適中，故選擇其作為參照峰(S)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取丸劑(批號X1708)粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，每次2 μL，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取丸劑(批號X1708)粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，每次2 μL，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取丸劑(批號X1708)粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，每次2 μL，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 UPLC指紋圖譜建立

2.5.1 共有峰標(biāo)定 取40批丸劑粉末，每批1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，指紋圖譜見圖1。將其以CDF格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評級系統(tǒng)”(2012版)，采用中位數(shù)法，設(shè)定時間窗為0.1，6號峰(厚樸酚)為參照峰，經(jīng)多點校正自動匹配后生成對照UPLC指紋圖譜，選擇圖譜中峰面積較大、分離度較好的色譜峰作為共有峰，結(jié)果共標(biāo)定出10個。

圖1 40批樣品UPLC指紋圖譜

2.5.2 共有峰指認 在“2.1”項條件下通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對色譜峰進行鑒定，通過紫外吸收光譜、精確分子量信息、相關(guān)文獻數(shù)據(jù)初步鑒定了10個共有峰，其中1～6號峰經(jīng)對照品確認，結(jié)果見圖2～3、表2。

表2 共有峰鑒定結(jié)果

圖2 樣品正、負離子TIC圖及UPLC圖

2.5.3 相似度評價 以圖3為參照，計算各批樣品相似度，結(jié)果見表3，可知均大于0.990，表明不同樣品之間的一致性較好。以6號峰(厚樸酚)為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%，但相對峰面積RSD在13%～34%之間，其中1、3、7號峰相差最大(RSD均大于21%)，見表4，表明各成分含量在不同批次樣品中存在一定差異。

表3 40批樣品相似度測定結(jié)果

表4 40批樣品共有峰相對峰面積測定結(jié)果

1．蕓香柚皮苷 2．橙皮苷 3．香蜂草苷 4．胡椒堿 5．和厚樸酚 6．厚樸酚 7．pipernonaline 8．guineensine 9．(2E,4E,12Z)-N-isobutylocatadeca-2,4,12-trienamide 10.(2E,4E,14Z)-N-isobutyleicosa-2,4,14-trienamide圖3 樣品對照UPLC色譜圖

2.6 化學(xué)模式識別

2.6.1 主成分分析(PCA)將40批樣品10個共有峰的峰面積進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到10階×40階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件中，得到方差貢獻率。結(jié)果，第一、第二、第三主成分貢獻率分別為46.8%、31.9%、9.8%，累積貢獻率達88.5%，可反映指紋圖譜共有峰的基本信息，再對其峰面積適當(dāng)權(quán)重后進行PCA分析，結(jié)果見圖4。由此可知，各樣品可聚為2類，S1～S16、S26～S40為Ⅰ類，S17～S25為Ⅱ類，并且Ⅱ類中1、3號峰相對峰面積明顯小于Ⅰ類，4、7號峰相對峰面積明顯大于Ⅰ類，可能是樣品聚為2類的主要原因。

圖4 40批樣品PCA得分圖

2.6.2 差異性成分篩選 根據(jù)“2.6.1”項下結(jié)果，將40批樣品分成A、B兩組，進一步通過OPLS-DA進行分析，結(jié)果見圖5。由此可知。R2Xcum(反映X矩陣解釋率)=0.863，R2Ycum(反映模型穩(wěn)定性)=0.973，Q2(反映模型預(yù)測性)=0.968，均大于0.5并接近1，表明模型穩(wěn)定可靠。

圖5 40批樣品OPLS-DA得分圖

再根據(jù)變量權(quán)重的重要性排序(VIP)值對共有峰進行篩選，結(jié)果見圖6，VIP值越大，對分組區(qū)分的貢獻率越大，差異越明顯[16-17]。本實驗以VIP值>1.2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出物蕓香柚皮苷(1號峰，來源于枳實)、香蜂草苷(3號峰，來源于枳實)、pipernonaline(7號峰，來源于蓽茇)為主要差異性成分，與表4一致。

圖6 10個共有峰VIP值

3 討論

本實驗對不同提取方法(冷浸、超聲、加熱回流)、提取溶劑(30%甲醇、70%甲醇、甲醇、95%乙醇)、提取時間(30、60、90 min)、料液比(1∶30、1∶50、1∶70)、流動相(甲醇-水，甲醇-酸水，乙腈-水，乙腈-酸水)、檢測波長(210、254、280、330 nm)、色譜柱[ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)]、柱溫(30、35、40、45 ℃)、體積流量(0.25、0.30、0.35、0.40 mL/min)進行考察，最終確定為“2.1.1”項下色譜條件。

結(jié)果顯示，40批肚痛丸(S1～S40)的相似度均大于0.99，表明其質(zhì)量在整體水平上具有較好的一致性；UPLC指紋圖譜中以6號峰為參照峰，共標(biāo)定10個共有峰；各批樣品分為2類，S17～S25聚為Ⅱ類，其余聚為Ⅰ類；3種差異性成分來自枳實(蕓香柚皮苷、香蜂草苷)、蓽茇(pipernonaline)，與峰面積分析結(jié)果一致，這也是造成樣品分為2類的主要原因，而且2類樣品中三者含量有差異，其原因可能為①Ⅱ類樣品在生產(chǎn)投料時，枳實中蕓香柚皮苷(峰1)、香蜂草苷(峰3)含量較低，而蓽茇中pipernonaline(峰7)含量較高；②樣品經(jīng)過長期貯存后，蓽茇中pipernonaline發(fā)生降解，故Ⅰ類樣品(較Ⅱ類樣品生產(chǎn)早1～2年)中其含量有所下降，同時蕓香柚皮苷、香蜂草苷、pipernonaline峰面積較小，也是40批樣品潛在的差異性成分，但三者在指紋圖譜中的貢獻較小。

綜上所述，UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別可快速、準(zhǔn)確地評價不同批次肚痛丸的質(zhì)量差異和重點成分，從而為全面控制和整體評價該制劑質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。