劉紫微， 王振亮△， 楊偉超， 謝 莎

(1.河南中醫(yī)藥大學， 鄭州 450046； 2.仲景宛西制藥股份有限公司， 鄭州 450046)

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種自身免疫性疾病，以皮膚增厚、組織或器官的局限性或彌漫性纖維化為主要臨床表現，80%左右的患者以肢端雷諾現象為首發(fā)癥狀，最終累及內臟出現心、肺和消化道器官病變，常見肺間質纖維化及肺動脈血管病變[1]。目前其發(fā)病機制尚未明確，研究表明血管內皮細胞損傷和活化是SSc發(fā)病的關鍵，受累組織廣泛的血管病變是本病的病理學特征之一。血管病變常累及小動脈、微細動脈和毛細血管，因血管內皮細胞和成纖維細胞的增生導致血管腔狹窄，進而出現血行瘀阻。

以往研究主要集中于麥門冬湯對SSc患者纖維化與免疫系統(tǒng)的影響。經實驗表明，麥門冬湯能通過提高CD4+、CD8+、T細胞含量調節(jié)SSc小鼠的免疫機制[2]，而血管病變的相關研究缺如。本次研究通過觀察麥門冬湯對SSc小鼠血管病變的改善作用，為其臨床應用提供實驗依據。本研究已通過河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查，批號DWLL201808071。

1 材料

1.1 動物

SPF級75只BALB/c雌性小鼠，體質量(20±5) g，5周齡，北京維通利華實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室，溫度(21±2)℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物

麥門冬湯組成：麥門冬60 g，人參6 g，半夏9 g，甘草4 g，大棗15 g，粳米6 g，由河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院中藥飲片房提供，煎煮濃縮至含生藥1 g/mL。麥門冬湯低、中、高劑量組給藥量分別為6.5/(kg·d)、13.0/(kg·d)、26.0 g/(kg·d)，以20 g小鼠和70 kg成人體表面積折算系數(0.0026)換算。

1.3 主要試劑及儀器

博萊霉素(Bleomycin，BLM，貨號621158)，上海生工生物工程股份有限公司；血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF，貨號EIA-2409)、小鼠抗內皮細胞自身抗體(anti-endothelial cell antibodies，AECA，貨號EIA-2285)、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2，貨號EIA-2540)、6-酮前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α，貨號EIA-2177)、ELISA定量試劑盒，蘇州艾萊薩生物科技有限公司；蘇木素染色液(貨號G1140)、伊紅染色液(貨號G1100)，北京索萊寶科技有限公司。

DL-5B型離心機(上海安亭科學儀器廠)；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；BL29-DG5031型標準酶標儀(北京中世遠達商貿有限公司)；LEICAEG1150型組織包埋儀(上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；LEICAST5020型組織染色機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；BX51TRF型顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；LGG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(合肥艾本森科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

75只BALB/c雌性小鼠按隨機數字表法分為正常組15只和造模組60只。制備SSc小鼠模型，用10%硫化鈉溶液脫去小鼠背部中央皮膚區(qū)域1 cm2×1 cm2的毛發(fā)并標記注射區(qū)域，正常組小鼠每日皮下注射0.1 mL PBS，造模組每日皮下注射0.1 mL BLM注射液(200ug/mL )，持續(xù)21 d。造模成功后，與正常組小鼠比較，造模組小鼠注射部位皮膚顯著增厚、硬化，皮損區(qū)無新生體毛。成模小鼠按隨機數字表法分為模型組、麥門冬湯低、中、高劑量組各15只。麥門冬低、中、高劑量組分別灌胃相應劑量的麥門冬湯，正常組和模型組灌胃同樣體積的蒸餾水，于每天上午9∶00及下午5∶00灌胃，連續(xù)21 d。實驗結束時正常組剩余小鼠14只，模型組13只，麥門冬湯低、中、高劑量組各15只。

2.2 標本采集

各組于末次灌胃后禁食不禁水24 h，摘眼球采血法取血，每只小鼠獲得全血樣本約1 mL，離心后分離出血清和血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｎi椎脫臼法處死小鼠，剪取背部備皮區(qū)皮膚，打開胸腔摘取雙側肺臟，迅速浸入10%多聚甲醛固定。

2.3 指標檢測與方法

2.3.1 一般情況觀測 觀測各組小鼠的體質量、色澤、食量以及精神狀態(tài)、活動情況、造模部位皮膚變化等情況。

2.3.2 蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察小鼠肺組織與皮膚病理形態(tài)學變化 各組分別選取厚度為1 cm的固定肺組織，將肺組織和皮膚組織放入包埋盒中，脫水后運用組織包埋儀進行石蠟包埋，切取3 μm的組織切片進行HE染色，封片后光鏡下觀察小鼠皮膚及肺組織結構。

2.3.3 ELISA檢測 嚴格按照ELISA試劑盒說明書描述方法測定血清中AECA以及血漿中vWF、TXB2、6-keto-PGF1α濃度。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠一般情況

給藥治療后與模型組比較，麥門冬湯低、中、高劑量組皮損程度均得到一定程度改善，其皮膚硬化程度緩解，彈性有所恢復，個別小鼠皮損區(qū)有新生體毛，麥門冬湯高劑量組效果最明顯。

3.2 各組小鼠皮膚、肺組織病理學比較

圖1示，正常組小鼠皮膚正常，無真皮層增厚及棘細胞層增生，未見膠原纖維增生，無炎癥細胞浸潤。模型組小鼠真皮層及棘細胞層明顯增厚，膠原纖維明顯增生，可見明顯炎性細胞浸潤。與模型組比較，麥門冬湯高、中劑量組真皮層及棘細胞層增厚，膠原纖維增生和炎性細胞浸潤程度明顯減輕，麥門冬湯低劑量組無明顯改變。

圖1示，正常組小鼠肺泡結構正常，肺血管壁無增厚、無炎性細胞浸潤及纖維化改變。模型組小鼠肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡萎陷、消失，肺血管壁明顯增厚，肺間質增厚，大量膠原纖維增生并伴炎癥細胞浸潤。與模型組比較，麥門冬湯高、中劑量組肺血管壁和肺間質增厚，膠原纖維增生以及炎癥細胞浸潤程度明顯改善，麥門冬湯低劑量組無明顯改變。

圖1 麥門冬湯對SSc小鼠皮膚、肺組織病理影響比較(HE×200)

3.3 各組小鼠血中AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α含量比較

表1示，與正常組比較，模型組小鼠血中AECA、vWF、TXB2含量均明顯升高(P<0.05)，6-keto-PGF1α因子含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，麥門冬湯低、中、高劑量組AECA、vWF、TXB2含量均有不同程度降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α含量均有不同程度升高(P<0.05)，其中麥門冬湯高劑量組效果最為明顯。

表1 麥門冬湯對小鼠血中AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α含量影響比較

4 討論

本研究以“肺朝百脈，輸精于皮毛”為切入點，研究系統(tǒng)性硬化癥引起的血管病變，通過觀察皮膚與肺組織病理切片，檢測AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α的含量，為中醫(yī)治療自身免疫性疾病提供實驗依據及治療思路。

根據SSc的臨床表現，其屬于中醫(yī)學“皮痹”范疇[3]，皮毛失養(yǎng)是其主要病機。皮毛發(fā)揮正常的生理功能有賴于衛(wèi)氣、津液以及血液的溫潤與濡養(yǎng)，而衛(wèi)氣的宣發(fā)、津液輸布以及血液運行皆與肺胃密切相關。衛(wèi)氣、津血皆為脾胃納運水谷所化之精微，通過肺氣宣降外達布散滋養(yǎng)于皮毛。肺胃之性皆喜潤惡燥，胃津不足，腐熟通降無權，衛(wèi)氣、津血化生失常，不足以濡潤皮毛；肺熱津涸，宣降失常，不能行衛(wèi)于表、敷津于膚、運血于皮，且肺朝百脈失常，行血力弱易生瘀滯；若久病不愈則更易感邪。正如《素問·痹論篇》所言：“皮痹不已，復感于邪，內舍于肺?！丙滈T冬湯為治療“氣火上逆，肺胃陰虛”證的代表方劑，用于治療肺胃津液耗傷、虛火上炎、熏灼于肺之證。方中麥門冬為君，以甘寒清潤之性益肺胃之陰以清其虛熱；人參為臣補脾益肺、益氣生津；粳米補中益氣兼止煩渴；大棗養(yǎng)胃健脾補中；生甘草清熱補脾潤肺、調和諸藥，三者配伍與人參相佐，共以“培土生金”之法使肺津源泉不竭；少佐溫燥之半夏，降氣止逆之余又防滋膩壅滯[4]。諸藥并用共奏清養(yǎng)肺胃、降逆下氣之功，胃和脾運則衛(wèi)氣津血源泉不竭，肺潤宣通則氣暢津布、血行暢運，衛(wèi)氣津血達散無阻。

SSc是以自身免疫和炎癥、眾多血管床中的小血管功能和結構異常導致皮膚和臟器進行性間質改變以及血管纖維化為主要特征[5]。由自身免疫反應導致的血管損傷是SSc發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，血管內皮細胞(endothelial cells，EC)是其發(fā)病的主要靶細胞[6]。AECA是一種以EC表皮異質性抗原為靶標，通過補體介導或抗體依賴細胞毒性破壞血管內皮細胞，以致血管損傷的自身免疫性抗體，是反映血管內皮細胞受損和血管炎的分子標志物[7]，其細胞外基質成分被發(fā)現與雷諾現象和SSc密切相關[8]。AECA介導內皮細胞和皮膚成纖維細胞活化，導致SSc的發(fā)生并定義了SSc的進程[9]。vWF是一種主要由EC合成的高分子血漿糖蛋白，在黏附聚集血小板于受損內皮過程中具有關鍵作用[10]，既是血管內皮損傷的一個敏感指標[11]，又是激活凝血機制的重要因素。血管內皮損傷后，vWF起首要作用，受損血管的內皮下成分首先與血液循環(huán)中的vWF結合，介導血小板的黏附，擴大血小板聚集，使抗纖溶因子釋放增多，纖溶系統(tǒng)被抑，同時利于凝血酶生成，加強凝血機制，導致微循環(huán)障礙[12-14]。有研究表明，在風濕病并發(fā)雷諾現象的發(fā)病機制中，vWF表達水平與雷諾現象發(fā)生率呈正相關，且vWF釋放越多SSc患者預后越差[11]。血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)是血小板合成的強血管收縮劑和血小板聚集誘導劑，前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)是EC合成的強血管擴張劑和血小板聚集抑制劑。血管內皮未受到損傷時兩者保持動態(tài)平衡，以維持血管的正常張力；血管損傷后使得止凝血與抗凝血機制失調，血管壁PGI2合成酶活性受抑則PGI2生成減少，血小板聚集則TXA2合成增高，且TXA2/PGI2比例失調[9,15]。由于TXA2和PGI2生物半衰期極短，TXB2與6-keto-PGF1α是TXA2與PGI2迅速轉化形成的穩(wěn)定而無生物活性的一對調節(jié)血管舒縮因子，所以一般通過測定血漿中TXB2和6-keto-PGF1α間接反映其含量[16]。SSc患者血管異常收縮痙攣、血液呈高凝狀態(tài)是發(fā)生雷諾現象的重要原因。研究發(fā)現，SSc患者的TXB2含量顯著升高，6-keto-PGF1α顯著降低，且TXB2/6-keto-PGF1α數值越高則患者雷諾現象越嚴重[17]。故TXB2和6-keto-PGF1α與SSc關系密切，以兩者的含量反映SSc引起的血管損傷程度極具意義。

本研究表明，麥門冬湯可能通過降低血清中AECA的含量，阻礙AECA與EC結合，防止EC被破壞，從而減輕血管損傷；可能通過減少血漿中vWF與TXB2含量，增加6-keto-PGF1α含量，減輕血管內皮血小板聚集與血管痙攣收縮，促進纖溶抑制血栓的形成，從而緩解微循環(huán)障礙，減輕由SSc引起的雷諾反應。麥門冬湯的劑量濃度與治療效果存在一定的量效關系，表明麥門冬湯濃度越高治療效果越好，但何時達到最佳療效仍有待進一步研究。實驗時通常要設置陽性對照組，以證明此治療方法優(yōu)于或等效其他藥物，因此確定麥門冬湯治療系統(tǒng)性硬化癥的最優(yōu)劑量濃度，且是否優(yōu)于現已知的臨床常規(guī)治療藥物是進一步研究的方向。綜上所述，麥門冬湯治療SSc機制之一可能與減輕血管損傷、緩解SSc患者血管病變有關。