王 洋， 唐 娟， 孫 鵬， 林師佈， 張 旭△

(1.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院，四川 內(nèi)江 641000； 2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 海南 ?？?570100)

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，2018年結(jié)直腸癌的確診病例超過180萬，是全球第三大常見癌癥[1，2]。大約25%的結(jié)直腸癌患者在最初診斷時(shí)就有轉(zhuǎn)移性疾病，而且在他們的疾病進(jìn)展過程中，有相似比例的患者會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[3，4]。目前，結(jié)直腸癌死亡率依然居高不下，主要原因是缺乏有效的治療藥物。因此，深入研究一種毒副作用小、價(jià)格低廉的藥物治療結(jié)直腸癌顯得尤為重要。山慈菇(Iphigenia Indica)為常用的抗腫瘤中藥之一，具有燥濕化痰、消腫和軟堅(jiān)散結(jié)等作用[5]。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道顯示，山慈菇也有廣泛的抗腫瘤、抗炎、抑制血管生成以及抑制疤痕增殖等作用，但其抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚未完全闡明[6，7]。星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)也被稱為異黏蛋白，最初在人類星形膠質(zhì)細(xì)胞受人免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus，HIV-1)感染或經(jīng)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)干預(yù)后被識(shí)別，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一種重要癌基因[8]。AEG-1在多種惡性腫瘤中呈異常高表達(dá)，并且與預(yù)后不良有密切關(guān)系[9-11]。姜維民等[12]研究表明，AEG-1蛋白表達(dá)升高可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。王軍等[13]通過免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸癌組織中AEG-1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AEG-1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且與腫瘤體積、Dukes分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。以上研究表明，AEG-1過表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但通過何種機(jī)制發(fā)揮作用，目前尚不明確。因此本研究以人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞為研究對象，觀察山慈菇提取物對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探究其分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞購自上海一研生物科技有限公司，貨號(hào)EY-8719。

1.2 主要藥物及試劑

山慈菇(云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖)(貨號(hào)7543437)，北京同仁堂藥店；AEG-1沉默重組慢病毒顆粒及陰性對照慢病毒顆粒，上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，NM_178812；DMEM和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(貨號(hào)C11995500BT、10099-141)美國Gibco公司；CCK-8試劑盒(貨號(hào)CA1210)、1%草酸銨結(jié)晶紫染色液(貨號(hào)G1062)，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞凋亡Hoechst染色試劑盒(貨號(hào)C0003)，碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗AEG-1、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白質(zhì)(Bax)、內(nèi)參GAPDH(貨號(hào)WL03007、WLO1556、WLO1637、WLO1114)和二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)WLA023)，沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

IX53奧林巴斯倒置顯微鏡，(上海普赫光電公司)；MHFL-2000倒置熒光顯微鏡，(廣州市明慧科技有限公司)；Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、NanoDrop 2000超微量紫外可見分光光度計(jì)購自美國Thermo公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 山慈菇提取物制備

精確稱量200 g山慈菇，粉碎，去離子水加熱、冷卻、過濾，再加入95%乙醇洗滌、蒸發(fā)、濃縮干燥后得到山慈菇干粉24 g。采用DMEM完全培養(yǎng)基制備山慈菇提取液濃度為 100、200、400、600和800 mg/L，經(jīng)0. 22 μm 微孔濾膜除菌和高壓滅菌后供實(shí)驗(yàn)使用。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種于6孔板中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，以轉(zhuǎn)染手冊中推薦的multiplicity of infection(MOI)值進(jìn)行感染，72 h后選取熒光率大于90%的孔繼續(xù)培養(yǎng)。Western blot檢測AEG-1的沉默效果，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染成功后分組為陰性對照組及AEG-1慢病毒轉(zhuǎn)染組。

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，在96孔板中24 h后各孔分別加入100 μL含有不同濃度山慈菇提取物完全培養(yǎng)液 (100、200、400、600和800 mg/L)，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入CCK-8試劑(10 μL)，培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞抑制率(%)=1-[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于6孔板中，加入終濃度為0、400和600 mg/L的山慈菇提取物處理24 h，更換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d。洗滌后進(jìn)行固定染色，洗去染色液，采集照片并計(jì)算細(xì)胞接種存活率即克隆形成率 =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

2.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱待細(xì)胞生長貼壁后，加入終濃度為0、400和600 mg/L的山慈菇提取物處理24 h，行Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行，奧林巴斯倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并采集圖片。

2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)

加入RIPA 裂解液(150 μL)裂解各組細(xì)胞、提取總蛋白，總蛋白樣品用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品25 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入一抗AEG-1、Bcl-2、Bax和GAPDH(抗體均1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL系統(tǒng)顯影。以 GAPDH 作為內(nèi)參，采集條帶灰度值用Image J 軟件計(jì)算：相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析和t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山慈菇提取物對SW480增殖的影響

表1示，與空白組比較，100和200 mg/L山慈菇提取物組作用24 h、48 h和72 h后，對細(xì)胞比較增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各濃度山慈菇提取物作用不同時(shí)間點(diǎn)，增殖抑制率與空白組比較均有顯著提高(P<0.05)。依據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取400和600 mg/L山慈菇提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 山慈菇提取物對SW480細(xì)胞增殖影響比較

3.2 山慈菇提取物對SW480細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖1表2示，與空白組比較，山慈菇提取物(400和600 mg/L) 細(xì)胞組克隆形成率逐漸降低(P<0.01)。

注：A、B和C分別為0 mg/L、400 mg/L和600 mg/L山慈菇提取物組。

表2 山慈菇提取物對SW480細(xì)胞克隆形成率的比較

3.3 山慈菇提取物對SW480細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2示，Hoechst 33258 染色后可見，0 mg/L山慈菇提取物干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)一致，細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，亮度均勻；不同濃度的山慈菇提取物(400和600 mg/L)作用后出現(xiàn)細(xì)胞核固縮或呈碎裂塊，且顏色有些發(fā)白，生成凋亡小體(紅色箭頭)。

注：A、B和C分別為0 mg/L、400 mg/L和600 mg/L山慈菇提取物組

3.4 山慈菇提取物對SW480細(xì)胞AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

圖3表3示，與空白組比較，山慈菇提取物(400和600 mg/L)細(xì)胞組，AEG-1和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，表明山慈菇提取物可呈劑量依賴性下調(diào)AEG-1和Bcl-2蛋白表達(dá)以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。

注：A、B和C分別為0 mg/L、400 mg/L和600 mg/L山慈菇提取物組；星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白質(zhì)(Bax)

表3 山慈菇提取物對SW480 AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

3.5 沉默AEG-1基因?qū)EG-1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

圖4表4示，與陰性對照組比較，AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中AEG-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，提示AEG-1基因表達(dá)受到抑制；同時(shí)沉默AEG-1組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，提示沉默AEG-1可下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。

注：A. 陰性對照組；B. AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組；星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2-associated X的蛋白質(zhì)(Bax)

表4 沉默AEG-1對SW480 細(xì)胞AEG-1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

3.6 沉默AEG-1對SW480細(xì)胞活性的影響

表5示，與陰性對照組比較，AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活性均明顯降低(P<0.05)，提示沉默AEG-1可抑制SW480細(xì)胞增殖。

表5 沉默AEG-1對SW480細(xì)胞活性影響比較

3.7 沉默AEG-1對SW480細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖5表6示，與陰性對照組比較，AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成率均明顯降低(P<0.05)，提示沉默AEG-1可抑制SW480細(xì)胞增殖。

注：A. 陰性對照組；B. AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組

表6 沉默AEG-1對SW480細(xì)胞克隆形成率比較

3.8 沉默AEG-1對SW480細(xì)胞形態(tài)的影響

圖6示，與陰性對照組比較，AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮或呈碎裂塊，且顏色有些發(fā)白，生成凋亡小體(紅色箭頭)，提示沉默AEG-1可抑制SW480細(xì)胞凋亡。

注：A. 陰性對照組；B. AEG-1沉默慢病毒轉(zhuǎn)染組

4 討論

山慈菇是普遍存在于自然界中的蘭科植物，其成本低、毒副作用小，同時(shí)具有消炎去腫、防止組織黏連和提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用[5,14]，并對多種腫瘤如人結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等具有抑制作用[5,15-17]，但山慈菇提取物抗人結(jié)直腸癌增殖作用及其具體機(jī)制尚未充分闡明。文章采用山慈菇提取物作用于人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制SW480細(xì)胞活性，細(xì)胞克隆形成能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)Hoechst 33258染色后，與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組可見SW480細(xì)胞形態(tài)皺縮并形成凋亡小體。研究表明，山慈菇提取物對人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，同時(shí)也具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

Bcl-2和Bax是凋亡相關(guān)蛋白，在凋亡信號(hào)通路中起決定性作用。正常條件下，Bax蛋白以單體形式存在于健康的細(xì)胞質(zhì)中[18，19]。張曉莉等[20]研究證實(shí)，紅花多糖能夠顯著抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)相關(guān)。研究西黃丸對人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480凋亡的影響，結(jié)果顯示西黃丸含藥血清增加了Bax蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[21]。另有藤黃酸對體外培養(yǎng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株增殖凋亡的影響實(shí)驗(yàn)表明，隨著藤黃酸濃度增加，細(xì)胞凋亡的百分比增加，且Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低[22]。本研究結(jié)果顯示，山慈菇提取物在體外促進(jìn)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的凋亡；進(jìn)一步的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山慈菇提取物可呈劑量依賴性下調(diào)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平。表明山慈菇提取物可通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的凋亡。

AEG-1于2002年被鑒定和克隆，是通過HIV-1和TNF-α誘導(dǎo)人類星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白[23]。近年來多項(xiàng)研究表明，AEG-1作為致癌因子在結(jié)直腸癌、肝癌、黑色素瘤等多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，并且與臨床分型、病理分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[24，25]。有研究表明，白細(xì)胞介素-8 (Interleukin-8，IL-8)通過與AEG-1相互作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而下調(diào)AEG-1表達(dá)則可減弱上述現(xiàn)象[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)，沉默AEG-1表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡[27]。也有報(bào)道顯示，通過檢測結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中AEG -1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AEG-1陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿或/和細(xì)胞膜，其在癌組織中的陽性表達(dá)率為73.1%(57/78)，顯著高于其在癌旁正常組織中的表達(dá)24.4%(19/78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且 AEG-1的表達(dá)與患者的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)[28]。在證實(shí)山慈菇提取物可以抑制人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的基礎(chǔ)上，繼續(xù)檢測山慈菇提取物對SW480細(xì)胞中AEG-1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示在SW480細(xì)胞中AEG-1蛋白呈陽性表達(dá)，山慈菇提取物可劑量依賴性地抑制AEG-1蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步探究山慈菇提取物對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，采用shRNA干擾技術(shù)抑制SW480細(xì)胞中AEG-1基因表達(dá)，結(jié)果顯示沉默AEG-1基因表達(dá)可顯著抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制SW480細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果表明，山慈菇提取物可通過下調(diào) AEG-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，從而抑制SW480細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。

本研究結(jié)果表明，山慈菇提取物可明顯抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該作用呈劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與抑制AEG-1蛋白表達(dá)、繼而下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平有關(guān)。山慈菇提取物的研發(fā)應(yīng)用有望成為治療人結(jié)直腸癌等腫瘤疾病的新方式。