鄭慧娥， 田浩梅， 何灝龍， 陳芯儀， 高音來， 陳楚淘

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 長沙 410208)

腦血管病屬于全球范圍的高危疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，給人類帶來諸多危害，包括身心危害、經(jīng)濟(jì)損失及社會關(guān)系損害等[1]。其中缺血性腦血管病約占腦血管病的4/5[2]，救治后可繼發(fā)腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)。CIRI主要病理表現(xiàn)為腦水腫及神經(jīng)元損傷[3]，臨床常以認(rèn)知障礙、運(yùn)動失調(diào)及感覺失靈為主要癥狀[4]，因此尋求安全有效的治療方法對CIRI有重要意義。

中醫(yī)治療腦卒中多以針刺聯(lián)合他法治療為多，且聯(lián)合治療效果往往更佳。針刺具有“簡便廉驗(yàn)”等特點(diǎn)，是治療腦血管病的常用治法[5]。亞低溫是唯一被臨床證實(shí)具有改善患者生存率及神經(jīng)功能預(yù)后的治療方法[6]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)高度保守且不具編碼作用，長度約為22個核苷酸，其分布范圍非常之廣包括動植物及人類等，且功能涉及到細(xì)胞的增殖分化、凋亡、分裂以及器官發(fā)育等[7]。此外有研究證實(shí)，miRNA種類及表達(dá)量于再灌注期間處于動態(tài)變化，可見miRNA與缺血再灌注的演變是相關(guān)的[8]。miR-106b-5p是miRNA成員之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖等功能[9]，且前期多認(rèn)為它是疾病診斷的重要因子[10，11]，然鮮有干預(yù)miR-106b-5p防治疾病的文獻(xiàn)報道。本研究應(yīng)用針刺與亞低溫相結(jié)合的方法，通過探討針刺結(jié)合亞低溫法對CIRI大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)差異miRNA功用及miR-106b-5p表達(dá)的調(diào)控作用，以期豐富針刺聯(lián)合治療腦缺血再灌注損傷機(jī)制研究，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查，批準(zhǔn)號20140403。

1 材料與方法

1.1 動物

90只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(265±15) g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(湘)2013-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心常溫環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右，確保自然光暗周期，濕度約60%。

1.2 主要試劑及儀器

4%多聚甲醛(維爾生物，WB0401)；1.5%TTC溶液(維爾生物，C19H15)；DEPC水(維爾生物，WB0006) ；miRNeasy Kit(Qiagen, 217004)；miRCURYTM芯片標(biāo)記試劑盒(Exiqon公司，208032-A)；Trizol(美國Invitrogen 公司，15596026)RT-PCR試劑盒(美國ABI公司，4334973)。

線栓(北京西濃科技，A4-263650)；肛溫溫度計(北京冀諾泰，JNT-LGJ)；數(shù)位溫度表(臺灣泰仕，TES1310)；熒光定量RCP儀(Thermo公司，PIKO REAL 96)；熒光定量PCR板(Thermo公司，SPL0960)。

1.3 動物分組及造模

90只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組15只、假手術(shù)組15只和造模組60只，假手術(shù)組僅插入線栓，不栓塞右側(cè)大腦中動脈(middle cerebral artery, MCA)。造模組60只大鼠參照Zea Longa[12]改良線栓法，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉后，給予頸部正中喉結(jié)旁作約10 mm切口，暴露頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(extra carotid artery, ECA)和頸內(nèi)動脈(inner carotid artery, ICA)。依次對CCA近心端及ECA近分叉口處進(jìn)行結(jié)扎，于CCA遠(yuǎn)心端做微小切口，并沿此切口經(jīng)CCA-ICA路徑插入線栓約18 mm，以黑色標(biāo)記點(diǎn)過ECA和ICA分叉起始點(diǎn)并感受阻力為度，栓塞右側(cè)MCA制備缺血模型，局部噴灑青霉素，縫合頸部正中切口并將線栓尾部固定于皮膚上。缺血2 h后(約90 min蘇醒)小心拔出線栓即完成CIRI模型。所有大鼠于缺血再灌注后2 h行神經(jīng)功能癥狀缺損評分：無神經(jīng)功能癥狀缺損記0分；提尾見栓塞動脈對側(cè)前肢屈曲記1分；行走見向栓塞動脈對側(cè)旋轉(zhuǎn)記2分；行走見向栓塞動脈對側(cè)傾倒記3分；術(shù)后失去意識者記4分。造模組1～3分大鼠納入實(shí)驗(yàn)，并采取相同實(shí)驗(yàn)方法對缺失大鼠進(jìn)行補(bǔ)齊。至此，造模組60只大鼠再次按照隨機(jī)數(shù)字表法依次分為模型組、亞低溫組、針刺組及針刺結(jié)合亞低溫組各15只。

1.4 干預(yù)方法

全部分組完成后各組大鼠行相應(yīng)治療。正常組不做任何處理；假手術(shù)組、模型組捆綁30 min，每次12 h共72 h；亞低溫組捆綁30 min，每次12 h，參考舒鑫[13]亞低溫法并加以改良，將大鼠置于放有冰袋和碎冰的代謝籠中維持肛溫(33±1) ℃和鼓膜溫度(31±1) ℃于亞低溫狀態(tài)72 h，每1 h監(jiān)測1次；針刺組捆綁并針刺“人中”“百會”“大椎”穴位[14]，捻轉(zhuǎn)法行針1 min并留針30 min(期間15 min時捻轉(zhuǎn)法行針1次，捻轉(zhuǎn)行針頻率90次/min)，每次12 h共治療72 h；針刺結(jié)合亞低溫組聯(lián)合使用針刺組和亞低溫組的處理方法。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 神經(jīng)功能癥狀評分 參照Zea Longa五級四分法，所有大鼠分別于造模后、72 h后完成神經(jīng)功能癥狀評分[12]。

1.5.2 梗死灶面積比測量 72 h后每組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后取全腦，冰凍固定，切片(約2 mm)后采用TTC 染色法，肉眼觀察梗死部位，數(shù)碼相機(jī)拍片，并用 BL-2000 圖像分析儀測定梗死面積比。

1.5.3 CIRI大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA功能檢測 72 h后每組隨機(jī)擇取5只大鼠，取患側(cè)(右)海馬用于抽提RNA，采用電泳法檢測RNA的完整性并篩選符合基因芯片試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的RNA樣品。從符合要求的RNA樣品中對miRNA依次進(jìn)行分離、標(biāo)記及濃縮等處理并進(jìn)行芯片雜交。使用GenePix 4000B Scanner掃描芯片，熒光波長為635 nm，應(yīng)用Genepix Pro 6.0提取熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，篩選并獲得每2組間差異表達(dá)miRNA(顯著性水平為P<0.05)，最后通過GO數(shù)據(jù)庫查詢相關(guān)差異miRNA的功能。

1.5.4 miR-106b-5p表達(dá)量檢測 72 h后每組隨機(jī)取5只大鼠。分離患側(cè)(右)海馬用于RNA提取，進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并運(yùn)用SYBR法進(jìn)行miR-106b-5p熒光定量PCR檢測，miR-106b-5p引物序列為：TAAAGTGCTGACAGT-GCAGAT。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法為多樣本完全隨機(jī)設(shè)計，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計量資料，組內(nèi)自身前后比較，符合正態(tài)分布者用配對t檢驗(yàn)，不符合者采用配對秩和檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布方差齊者采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺結(jié)合亞低溫對CIRI大鼠神經(jīng)功能癥狀評分的影響

表1示，造模后組間比較，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組、亞低溫組、針刺組及針刺結(jié)合亞低溫組神經(jīng)功能癥狀評分顯著升高(P<0.01)，提示模型制備成功。組內(nèi)與造模后比較，72 h后正常組、假手術(shù)組及模型組的神經(jīng)功能癥狀評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而3個治療組(亞低溫組、針刺組及針刺結(jié)合亞低溫組)的神經(jīng)功能癥狀評分均顯著下降(P<0.01)，因此認(rèn)為3種治療方式均可改善CIRI大鼠神經(jīng)功能癥狀。72 h后組間比較，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能癥狀評分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，亞低溫組及針刺組神經(jīng)功能癥狀評分明顯下降(P<0.05)，針刺結(jié)合亞低溫組的神經(jīng)功能癥狀評分極其顯著下降(P<0.01)，提示針刺結(jié)合亞低溫法改善神經(jīng)功能癥狀更具優(yōu)勢。

表1 針刺結(jié)合亞低溫對CIRI大鼠神經(jīng)功能癥狀評分的影響[M(Q)]

2.2 針刺結(jié)合亞低溫對CIRI大鼠腦組織梗死灶面積比的影響

圖1示，紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)槿毖X組織，即圖中藍(lán)色箭頭所指。正常組及假手術(shù)組未見缺血組織，模型組可見大片缺血組織，亞低溫組及針刺組可見明顯缺血組織，而針刺結(jié)合亞低溫組僅見小片缺血組織。

圖1 各組大鼠梗死面積TTC染色圖

表2示，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組梗死面積比顯著上升(P<0.01)，提示CIRI模型制備成功。與模型組比較，亞低溫組、針刺組及針刺結(jié)合亞低溫組梗死面積比顯著下降(P<0.05或P<0.01)，因此認(rèn)為3種治療手段均能有效改善CIRI梗死面積。與亞低溫組比較，針刺組梗死面積比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，針刺結(jié)合亞低溫組梗死面積比明顯下降(P<0.05)，說明針刺結(jié)合亞低溫優(yōu)于單用亞低溫的作用效果。

表2 針刺結(jié)合亞低溫對CIRI大鼠缺血側(cè)梗死面積比影響比較[M(Q)]

2.3 基因芯片檢測結(jié)果

2.3.1 CIRI大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA表達(dá)譜 圖2示，CIRI大鼠缺血側(cè)海馬組織差異miRNA聚類分析圖，橫列示差異miRNA，縱列示樣本組織，其中紅色熒光所示為高表達(dá)，綠色熒光所示為低表達(dá)。

圖2 CIRI大鼠缺血側(cè)海馬組織差異miRNA聚類分析圖

2.3.2 各組間差異miRNA功能情況 圖3示，與正常組比較，模型組差異表達(dá)4種miRNA，功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡，提示造模后部分差異表達(dá)miRNA參與CIRI過程，其功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡。與假手術(shù)組比較，模型組差異表達(dá)5種miRNA；與模型組比較，亞低溫組差異表達(dá)7種miRNA，針刺組差異表達(dá)16種miRNA及針刺結(jié)合亞低溫組差異表達(dá)23種miRNA，且差異miRNA功能均涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元分化、軸突延伸、基因表達(dá)及炎癥反應(yīng)，可見治療后差異表達(dá)miRNA功能豐富。

圖3 各組間差異miRNA功能比較

2.4 CIRI大鼠缺血側(cè)海馬組織miR-106b-5p表達(dá)量

表3示，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血側(cè)海馬區(qū)miR-106b-5p表達(dá)量顯著上升(P<0.01)，提示miR-106b-5p上調(diào)參與CIRI過程。與模型組比較，3個治療組大鼠腦缺血側(cè)海馬區(qū)miR-106b-5p表達(dá)量均下降(P<0.05或P<0.01)，提示3種治療方式均下調(diào)CIRI后缺血側(cè)組織miR-106b-5p表達(dá)。與亞低溫組比較，針刺組大鼠腦缺血側(cè)海馬區(qū)miR-106b-5p表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，針刺結(jié)合亞低溫組大鼠腦缺血側(cè)海馬miR-106b-5p表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，說明針刺結(jié)合亞低溫下調(diào)miR-106b-5p的表達(dá)較單一亞低溫處理更具優(yōu)勢。

表3 各組miR-106b-5p相對表達(dá)量比較

3 討論

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要并發(fā)癥，屬于中醫(yī)學(xué)“卒中”“中風(fēng)”[15]范疇。其病情是缺血性腦卒中恢復(fù)血供后繼發(fā)的腦組織損傷，較之原發(fā)病更為復(fù)雜[16]。迄今為止，抗腦缺血再灌注損傷治療多從抗炎、抗氨基酸毒性作用、抗鈣離子超載、抗一氧化氮累積及抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制展開研究[17]，而從基因視角探討抗CIRI的治療鮮有報道。針刺是中醫(yī)臨床治療腦病的常用手段，可以較好地改善患者運(yùn)動障礙等后遺癥，同時有臨床研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫法可有效降低大面積急性腦梗死神經(jīng)功能缺損評分，提升臨床治療效果[18，19]。諸多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，單純針刺或亞低溫療法均對CIRI后miRNA的表達(dá)有著重要的調(diào)控作用[20，21]。故本研究將中醫(yī)針刺與亞低溫結(jié)合作為干預(yù)手段，從基因水平探討針刺結(jié)合亞低溫抗腦缺血再灌注損傷作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與模型組比較，治療組的神經(jīng)功能癥狀評分及腦梗死面積比均下降，說明無論是單獨(dú)針刺或亞低溫，亦或是聯(lián)合針刺與亞低溫的治療方法均能有效改善CIRI神經(jīng)功能癥狀及腦梗死面積。

miRNA家族種類繁多，功能豐富，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等功能活動，與疾病的演變密切相關(guān)[22，23]。如miRNA可通過參與腦缺血再灌注過程的神經(jīng)發(fā)生、炎癥反應(yīng)、腦水腫、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激等影響CIRI演變[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后4種miRNA發(fā)生差異表達(dá)，其功能僅調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡。而應(yīng)用亞低溫、針刺及針刺結(jié)合亞低溫治療后，與模型組比較，各治療組差異miRNA不僅種類大幅增加，而且功能也更為豐富，除可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡外，還可調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化、軸突延伸、基因表達(dá)及炎癥反應(yīng)，由此可見CIRI損傷的修復(fù)與差異miRNA功能的豐富相關(guān)。而與其他2種治療方法比較，針刺結(jié)合亞低溫組各功能的差異miRNA數(shù)量占據(jù)明顯優(yōu)勢，可見針刺結(jié)合亞低溫抗CIRI的效果與激發(fā)差異miRNA功能密切相關(guān)。

miR-106b-5p是miRNA家族成員之一，與諸多疾病的診斷、治療及預(yù)后有關(guān)[10，11]。李鵬飛等[25]認(rèn)為，血清中miR-106b-5p對提高診斷缺血性腦卒中的準(zhǔn)確性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)在造模后發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p表達(dá)上調(diào)，與上述觀點(diǎn)一致，可見miR-106b-5p的表達(dá)水平關(guān)乎CIRI的發(fā)生。而運(yùn)用亞低溫、針刺及針刺結(jié)合亞低溫法干預(yù)后可下調(diào)miR-106b-5p表達(dá)，說明這幾種治療手段均可通過下調(diào)miR-106b-5p，改善CIRI實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)，且下調(diào)miR-106b-5p表達(dá)量或決定了CIRI改善程度。

針刺治療腦血管疾病的療效值得肯定[26]，但事實(shí)上單純針刺法治療腦卒中在臨床并不常見，多聯(lián)合使用其他手段進(jìn)行治療，如針電結(jié)合、針?biāo)幗Y(jié)合及針刺聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練等方法，在獲得不錯的臨床效果的同時，也普遍被患者及患者家屬所接受[27-29]。而諸多研究同樣證實(shí)，亞低溫可從多方面達(dá)到抗CIRI的目的[30]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用針刺結(jié)合亞低溫法治療CIRI大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺結(jié)合亞低溫法對改善CIRI神經(jīng)功能癥狀及腦梗死面積較單純針刺或亞低溫法更具優(yōu)勢。

綜上所述，針刺結(jié)合亞低溫法可有效改善CIRI，且其機(jī)制或與miRNA功能及下調(diào)miR-106b-5p表達(dá)量進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)有關(guān)，值得臨床推廣應(yīng)用。